林漢卿,溫貴蘭,汪德生,張升波,徐 麗,李昌紅

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥和馬立克病是禽類(lèi)最為常見(jiàn)的3種腫瘤病,可導(dǎo)致家禽出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫抑制,繼發(fā)感染其他疾病,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大。出現(xiàn)混合感染時(shí),疾病的致病力和致腫瘤能力都遠(yuǎn)大于單一感染,導(dǎo)致的免疫抑制也更為嚴(yán)重。禽白血病由禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒科的禽白血病病毒(ALV)引起,根據(jù)病毒囊膜糖蛋白gp85抗原性的差異,ALV可分為A～J 10個(gè)亞群,J亞型禽白血病病毒(ALV-J)是最近較為流行的外源性病毒,可引起雞的骨髓細(xì)胞瘤。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒是RE的病原,主要引起雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉等產(chǎn)生急性網(wǎng)狀細(xì)胞增生、矮小綜合征及免疫器官萎縮。根據(jù)與單克隆抗體反應(yīng)的差異,將REV分為I、II和III型3種不同亞型,我國(guó)目前流行的REV以III型為主。雞馬立克病(MD)的特征是淋巴組織增生性紊亂,病原為雞馬立克病病毒(MDV)。依據(jù)其生物學(xué)特性可將MDV分成3個(gè)血清型,其中只有血清1型MDV(MDV-1)具有致病力。Witter等人[1]依據(jù)毒株毒力的不同,將 MDV-1進(jìn)一步分為溫和毒(mMDV)、強(qiáng)毒(vMDV)、超強(qiáng)毒(vvMDV)及特超強(qiáng)毒(vv+MDV)。MDV的致瘤相關(guān)基因有meq基因、pp38基因、vTR基因等,其中meq基因?yàn)镸DV-1特有[2]。MDV的毒力和致瘤能力都有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì),對(duì)疫苗的抵抗力也在增加。近年來(lái),各個(gè)地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)兩種或3種腫瘤病混合感染的報(bào)道,腫瘤病發(fā)展得越來(lái)越復(fù)雜,防控難度也在增大。2017年8月,貴州省某土雞養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了一起以步態(tài)不穩(wěn)、歪脖、雞冠腫瘤為特征的傳染性疾病,經(jīng)病理剖檢、PCR鑒定和序列分析,判定該雞場(chǎng)存在禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥和馬立克病的混合感染。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒材料為貴州省某雞場(chǎng)送檢的土雞組織病料,大腸埃希菌DH5α,購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;2 ×EsTaqMaster Mix、pMD-18T、連接酶 Solution I、DL-2 000 Marker,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒,購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司,RNA提取試劑盒,購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司,瓊脂糖凝膠回收試劑盒,購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 詢(xún)問(wèn)養(yǎng)殖戶(hù)雞群信息,觀察送檢病雞的臨床表現(xiàn),仔細(xì)檢查病雞皮膚有無(wú)異常。在無(wú)菌條件下解剖病雞,觀察病理變化并記錄。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的ALV-J原型毒株 HPRS-103(GenBank登錄號(hào)：Z46390)的gp85基因序列、MDV美國(guó)毒株 RBIB(GenBank登錄號(hào)：AY243332.1)的meq基因序列和REV的SNV株(GenBank登錄號(hào)：DQ003591)的env基因序列,用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物。引物的堿基序列見(jiàn)表1,引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3 PCR鑒定 按常規(guī)方法提取病雞組織RNA并反轉(zhuǎn)錄,用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物分別對(duì)所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL,2×Es TaqMaster Mix 12.5 μL,上下游引物各 1 μL,ddH2O 8.5 μL,反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,58℃退火1 min,72℃延伸1 min,共33個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 目的基因的克隆與序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,利用膠回收純化試劑盒分別純化回收PCR產(chǎn)物,用Solution I連接酶將3個(gè)純化產(chǎn)物與pMD-18T載體16℃連接過(guò)夜,并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。菌液在含氨芐的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后,挑取單個(gè)菌落純培養(yǎng),取2 μL菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè),將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌液送至廣州立菲生物公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果 送檢雞場(chǎng)每天的死亡數(shù)為10多只,雞群免疫過(guò)禽流感疫苗和新城疫疫苗,未免疫馬立克病疫苗,雞群發(fā)病后使用過(guò)很多抗菌藥物,均無(wú)明顯效果。送檢雞為130日齡左右,病雞出現(xiàn)呼吸困難、站立不穩(wěn)、歪脖等現(xiàn)象(見(jiàn)中插彩版圖1),肉髯腫瘤結(jié)節(jié)(見(jiàn)中插彩版圖2),剖檢可見(jiàn)心臟、脾臟(見(jiàn)中插彩版圖3)、腸系膜等處有明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。肝臟有明顯出血點(diǎn),腎臟、脾臟明顯腫大,腺胃、肌胃和氣管有不同程度的出血。

圖1 病雞出現(xiàn)歪脖現(xiàn)象

圖2 肉髯腫瘤結(jié)節(jié)

圖3 脾臟灰白色結(jié)節(jié)

2.2 ALV-Jgp85基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及序列分析

gp85基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增出約921 bp的特異性條帶,與預(yù)期條帶一致?？寺『笏统鰷y(cè)序,將所得序列命名為GZ2017-ALV。用DNAStar7.1生物學(xué)軟件比對(duì),核苷酸同源性分析顯示,GZ2017-ALV跟J亞型毒株HuB09JY04、GZD17的核苷酸同源性最高,都為99.3%,與J亞型原型毒株NXO1O1的同源性為96.7%,與其他亞型的同源性?xún)H有45.3% ～47.2%。遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示(圖4),GZ2017-ALV與J亞型毒株GX13LT02親緣關(guān)系最近,與其他J亞型毒株都處于同一大分支,與A、B、D、E亞型毒株均處于不同分支。

圖4 ALV gp85基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 REVenv基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及序列分析REVenv基因經(jīng)擴(kuò)增后,出現(xiàn)約615 bp的特異性條帶,與預(yù)期條帶一致?？寺『笏统鰷y(cè)序,得到618 bp大小的堿基序列,編碼206個(gè)氨基酸,將其命名為GZ2017-REV。與GenBank上傳的 REV分離株進(jìn)行比對(duì),GZ2017-REV與分離株CY1111和2012001-2的核苷酸同源性最高,為95.1%,與Ⅲ型代表株CSV的核苷酸同源性也相對(duì)較高,為94.5%,與Ⅰ型代表株170A的核苷酸同源性為92.1%,與Ⅱ型代表株SNV的核苷酸同源性則相對(duì)較低,為90.7%。遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示(圖5),GZ2017-REV與2012001-2處于同一小分支,與CSV和170A處于同一大分支,SNV則與HQSC2024和GD1210在另一分支。

圖5 REV env基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

2.4 MDVmeq基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及序列分析MDVmeq基因經(jīng)擴(kuò)增后,出現(xiàn)與預(yù)期條帶一致的約522 bp的特異性條帶?？寺『鬁y(cè)序得到522 bp大小的序列,編碼174個(gè)氨基酸,命名為 GZ2017-MDV。將其與GeneBank上的16株分離株比對(duì)分析,核苷酸同源性高達(dá)98.5% ～99.6%。與美國(guó)vvMDV代表株RBIB的核苷酸同源性為98.9%,與vv+MDV代表株N的核苷酸同源性則為99.4%(圖6)。

3 討論

禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥和馬立克病是目前危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的3類(lèi)腫瘤病,隨著病毒的進(jìn)化,3種腫瘤病之間的混合感染越發(fā)嚴(yán)重,病毒間相互的協(xié)同作用使得病毒更難以控制。近幾年來(lái),各地相繼出現(xiàn)了雞傳染性貧血病病毒、傳染性腔上囊病病毒等與ALV、REV、MDV的混合感染[3-5],但貴州省還未見(jiàn)ALV、REV、MDV混合感染的報(bào)道。根據(jù)病理變化、PCR鑒定和序列分析結(jié)果,可判定貴州省某雞場(chǎng)發(fā)生了 ALV-J、REV和 MDV的混合感染。

ALV-J于2000年首次在中國(guó)分離到,宿主范圍廣泛、進(jìn)化迅速,目前已成為最為流行的禽白血病病毒亞型。gp85基因作為決定亞群特異性的主要蛋白,在ALV-J的進(jìn)化和變異中起到了至關(guān)重要的作用[6]。分析顯示,A～E亞群相互間的gp85基因的同源性大于80%,而J亞群與其他亞型間gp85基因的同源性只有40%左右,因此常選用gp85基因來(lái)鑒別ALV-J[7]。本試驗(yàn)測(cè)序得到的GZ2017-ALV的gp85基因跟GenBank中J亞型ALV標(biāo)準(zhǔn)毒株的gp85基因同源性為96.7% ～99.3%,與其他亞型的同源性?xún)H有45.3% ～47.2%,說(shuō)明流行株GZ2017-ALV是J亞型禽白血病病毒。REV作為一種反轉(zhuǎn)錄病毒,不僅能整合到宿主的基因組中垂直傳播給下一代,還能整合到MDV基因組中引起復(fù)雜的混合感染[8],因此難以根除,目前尚無(wú)有效的防控辦法。根據(jù)與單克隆抗體反應(yīng)的差異,REV可分為3型,I、II、III型的代表株分別為 170A、SNV、CSV,我國(guó)內(nèi)地的REV流行株以III型為主[9],也有部分為I型,II型REV鮮有報(bào)道。流行株GZ2017-REV與170A、SNV、CSV的核苷酸同源性分別為92.1%、90.7%和94.5%,遺傳進(jìn)化樹(shù)表明其與170A、CSV的親緣關(guān)系相對(duì)較近,說(shuō)明GZ2017-REV很可能是目前較為流行的III型REV。MD不僅是一種腫瘤病,還能侵害動(dòng)物的神經(jīng)。本試驗(yàn)的病雞出現(xiàn)頭頸歪斜很可能是控制頸肌的神經(jīng)受害引起的,呼吸困難可能是由于迷走神經(jīng)受到侵害,而步態(tài)不穩(wěn)則是由于坐骨神經(jīng)受侵害,這也是MD的典型癥狀。meq基因作為公認(rèn)的致腫瘤相關(guān)基因,與MDV的毒力有一定關(guān)聯(lián),且保守性較強(qiáng),是近年的研究熱點(diǎn)[10-11]。對(duì)病雞的meq基因進(jìn)行克隆和序列分析,結(jié)果表明,流行株GZ2017-MDV與各分離株的核苷酸同源性為98.5% ～99.6%,與vv+MDV代表株N的核苷酸同源性高達(dá)99.4%,說(shuō)明GZ2017-MDV是特超強(qiáng)毒株的可能性比較大。

目前AL和RE都沒(méi)有有效疫苗,市面上雖有MD疫苗,但MDV毒力的不斷增強(qiáng),以及ALV和REV兩種病毒對(duì)動(dòng)物機(jī)體的侵害,使得疫苗的免疫效果減弱,常出現(xiàn)免疫失敗。要阻止腫瘤疾病的傳播,種群凈化必不可少。