曹校瑞,高淑媛,牛 姝,程笳琪,赫曉燕

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西太谷030801)

毛囊是皮膚重要而復(fù)雜的附屬結(jié)構(gòu),是一個(gè)再生組織,不斷經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退化期和靜止期3個(gè)時(shí)期,這個(gè)過(guò)程叫做毛發(fā)周期。其中,小鼠出生后1～23 d為毛囊的第一生長(zhǎng)周期,其中1～12 d為生長(zhǎng)期,13～18 d為退化期,19～22 d為靜止期,23 d毛囊進(jìn)入再生長(zhǎng)期。毛囊第一生長(zhǎng)周期作用過(guò)程復(fù)雜,由多種酪氨酸蛋白激酶受體生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié),包括胰島素生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血小板源性生長(zhǎng)因子。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factors,FGF)家族的成員參與很多不同類(lèi)型細(xì)胞的增殖、遷移、分化和存活,參與控制血管生成[1-2],通過(guò)與其受體FGFR結(jié)合來(lái)進(jìn)一步調(diào)控毛發(fā)的生長(zhǎng)。

FGF11和FGF13都是FGF11亞家族的成員,在舌頭發(fā)育中,FGF11和 FGF13都有表達(dá),其中FGF11作用有限,FGF13可能參與間葉細(xì)胞增殖和分化[3],但FGF13的功能基本上仍是未知的,FGF13在胚胎中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)也有顯著廣泛的表達(dá)[4]。FGF18屬于FGF8亞族的一員,FGF18是多向性的生長(zhǎng)因子,可以刺激間葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞和組織的增殖,如肺、腎、心、睪丸、脾臟、骨骼、肌肉和大腦[5]。然而FGF11在皮膚毛囊形成和發(fā)育過(guò)程中作用的研究從未報(bào)道過(guò),有報(bào)道提到FGF13在出生后1～4 d的新生小鼠皮膚毛囊隆起部和基底層高表達(dá),FGF18信號(hào)在成年小鼠毛囊發(fā)育靜止階段維持毛囊干細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài),促進(jìn)毛囊從靜止期向生長(zhǎng)期過(guò)渡[6-10]。但是在出生后小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育第一個(gè)周期中,這3個(gè)生長(zhǎng)因子是如何表達(dá)的,起到什么作用,還沒(méi)有系統(tǒng)全面的研究過(guò)。本試驗(yàn)首先采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)FGF11、FGF13和FGF18蛋白在小鼠毛囊第一生長(zhǎng)周期的背部皮膚中的分布,其次采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)從基因水平檢測(cè)FGF11、FGF13和FGF18基因在小鼠毛囊第一生長(zhǎng)周期背部皮膚中的表達(dá)量,最后通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)FGF11、FGF13和FGF18蛋白在小鼠毛囊第一生長(zhǎng)周期背部皮膚中的表達(dá)量。旨在探究FGF11、FGF13和FGF18對(duì)小鼠毛囊第一生長(zhǎng)周期的影響,為研究毛發(fā)生長(zhǎng)機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及取材 從山西醫(yī)科大學(xué)購(gòu)買(mǎi)ICR小鼠(動(dòng)物合格證號(hào)：0107010),飼養(yǎng)一段時(shí)間,待小鼠適應(yīng)新環(huán)境后,進(jìn)行合籠。從觀察到陰道栓開(kāi)始記懷孕天數(shù)。 取出生后 3、5、8、13、16、18、20 d 和23 d小鼠背部皮膚,每次隨機(jī)選取3只日齡相同的小鼠的皮膚組織,每只小鼠背部皮膚取若干分為三部分,其中一部分先用Bouin氏固定液進(jìn)行固定,隨后進(jìn)行組織包埋。剩下二部分放入液氮中保存。

1.2 主要試驗(yàn)藥品、試劑與耗材 FGF11兔抗多克隆抗體(Biorbye,Orb101545)、FGF13兔抗多克隆抗體(Abcam,Ab153808)、FGF18兔抗多克隆抗體(Biorbye,Orb1778)、兔 Streptavidin-HRP試劑盒(康為公司)、TRIZol Reagent(Invitrogen公司);SYBR PremixEx TaqⅡ、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)等。

2 方法

2.1 免疫組化

2.1.1 石蠟切片的制備 常規(guī)方法制片,片厚6 μm。試驗(yàn)組織修整→脫水、透明→浸蠟→包埋→修塊→切片、展片、烤片→做好標(biāo)記,放入切片盒備用。

2.1.2 免疫組織化學(xué)試驗(yàn) 采用免疫組化試劑盒,按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)。切片脫蠟與復(fù)水→封閉→陽(yáng)性組滴加兔抗 FGF11(1∶150)、FGF13(1∶200)、FGF18(1∶200)、對(duì)照組滴加同等體積PBS緩沖液→4℃過(guò)夜孵育→磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗→滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗工作液,孵育10 min→PBS緩沖液沖洗→滴加鏈酶親和素(SABC)→PBS緩沖液沖洗→二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)+H2O2顯色→蘇木精染色→封片→觀察,采集圖像,每個(gè)樣品取6張切片,每張切片選取五個(gè)視野。

2.1.3 圖像采集與數(shù)據(jù)分析 使用圖像分析軟件Image-pro plus6.0,對(duì)每張切片采集的5個(gè)視野進(jìn)行分析,得出每個(gè)樣品的陽(yáng)性反應(yīng)平均光密度值。使用SPPS17.0軟件分析統(tǒng)計(jì)表得到每組值的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,進(jìn)行方差分析。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

2.2.1 小鼠背部皮膚總RNA及cDNA的提取 采用TRIZol法,提取出生后小鼠背部皮膚總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)完成后,測(cè)量濃度,放在-20℃保存。

2.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 登錄NCBI查詢小鼠FGF11、FGF13、FGF18及內(nèi)參β-actin基因的序列,用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列如下：

將上述引物送華大基因科技服務(wù)有限公司合成,之后進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,切膠條送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序成功后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

2.2.3 熒光定量 PCR檢測(cè) FGF11、FGF13、FGF18在出生后小鼠皮膚中的表達(dá) 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FGF11、FGF13、FGF18在出生后小鼠皮膚中的表達(dá)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,β-actin作為內(nèi)參基因及上述引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。制備好反應(yīng)體系后在StepOnePlus Real-Time PCR中進(jìn)行擴(kuò)增。按照RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)操作,每個(gè)樣品4個(gè)重復(fù),反應(yīng)體系為10 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s,95℃ 5 s,57℃ 30 s,72℃ 15 s,循環(huán)數(shù)為40個(gè),終延伸72℃ 10 min。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT,所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,熒光實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示,其中各基因的表達(dá)量所示結(jié)果均由內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)量進(jìn)行校正,所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。

2.3 蛋白免疫印跡技術(shù)

2.3.1 出生后小鼠背部皮膚總蛋白的提取 根據(jù)總蛋白提取試劑盒的試驗(yàn)步驟說(shuō)明書(shū)提取皮膚組織的總蛋白,測(cè)定濃度后將樣品放入-80℃保存。

2.3.2 蛋白免疫印記(Western Blot)每個(gè)樣品總蛋白上樣量為300 μg,每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),根據(jù)濃度算出體積?？傮w系30 μL,之后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。經(jīng)制膠和加樣、電泳和轉(zhuǎn)膜后,在孵育盒中配制抗體 FGF11(1∶300)、FGF13(1∶400)、FGF18(1∶300)進(jìn)行4℃過(guò)夜孵育后得出含有蛋白印記的NC膜,按照eECL Western Blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制發(fā)光液,均勻涂在NC膜上,用凝膠成像儀曝光,暗室壓膠片。

2.3.3 蛋白免疫印記圖像分析 利用Image J分析FGF11、FGF13、FGF18蛋白和β-actin蛋白條帶灰度值,然后用軟件分析數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,在小鼠背部皮膚真皮乳頭、毛基質(zhì)、外根鞘、膨大部、皮脂腺和表皮均有FGF13的免疫陽(yáng)性反應(yīng),主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),在陰性對(duì)照組均未見(jiàn)FGF13的陽(yáng)性反應(yīng)(見(jiàn)中插彩版圖1 A-D a-d)。在小鼠背部皮膚真皮乳頭、毛基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘、皮脂腺、膨大部和表皮均有FGF18的免疫陽(yáng)性反應(yīng),在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá),在陰性對(duì)照組均未見(jiàn)FGF18的陽(yáng)性反應(yīng)(見(jiàn)中插彩版圖1 E-H e-h)。在小鼠背部皮膚真皮乳頭、毛基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘和皮脂腺均有FGF11的免疫陽(yáng)性反應(yīng),在陰性對(duì)照組均未見(jiàn)FGF11的陽(yáng)性反應(yīng)(見(jiàn)中插彩版圖1 I-L i-l)。 FGF11、FGF13、FGF18 的光密度值見(jiàn)表 1。

表1 出生后小鼠背部皮膚FGF11、13、18蛋白陽(yáng)性反應(yīng)物平均光密度值

3.2 RT-PCR結(jié)果 如圖2,經(jīng)過(guò)PCR儀擴(kuò)增,得到大小分別為109 bp、121 bp、132 bp 的 FGF11、FGF13、FGF18基因核酸片段。在NCBI將測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)后確實(shí)為小鼠的FGF11、FGF13、FGF18基因。

圖1 FGF13、FGF18、FGF11蛋白在出生后小鼠背部皮膚中的表達(dá)

圖2 FGF11、FGF13、FGF18基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

通過(guò) RT-PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定了 FGF11、FGF13、FGF18基因在小鼠背部皮膚中的相對(duì)表達(dá)量,β-actin作為內(nèi)參基因。利用2-ΔΔCT法得于出生后小鼠皮膚FGF11、FGF13、FGF18 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,出生后3天的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組,其統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖3,出生后FGF11 mRNA在5日齡表達(dá)量最高,在生長(zhǎng)期表達(dá)量逐漸下降;FGF13 mRNA表達(dá)量在生長(zhǎng)期逐漸下降,靜止期及退化期逐漸上升;FGF18 mRNA表達(dá)趨勢(shì)與FGF11相似。

3.3 蛋白免疫印跡結(jié)果 通過(guò)Western Blot檢測(cè)FGF11、FGF13、FGF18在小鼠背部皮膚組織中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：在不同日齡小鼠背部皮膚中均有FGF11、FGF13、FGF18蛋白的存在,大小依次為 25 kDa、25 kDa、28 kDa,出生后,FGF11在5日齡表達(dá)最高,但是整體并沒(méi)有一定的趨勢(shì);FGF13在3日齡表達(dá)最高,13日齡表達(dá)最低,從16日齡表達(dá)量開(kāi)始上升;FGF18在3日齡小鼠背部皮膚中表達(dá)量最高,16日齡最低,從18日齡開(kāi)始表達(dá)量又開(kāi)始上升。其條帶見(jiàn)圖4,蛋白分析統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖5。

圖3 出生后小鼠背部皮膚FGF11、FGF13、FGF18和β-actin基因相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)

圖4 出生后小鼠背部皮膚FGF11、FGF13、FGF18和β-actin的曝光條帶

圖5 FGF11、FGF13、FGF18在出生后小鼠背部皮膚組織中蛋白印記分析統(tǒng)計(jì)圖

4 討論

出生后,毛囊出現(xiàn)周期性的活動(dòng)模式,這種循環(huán)模式被稱作是毛發(fā)周期[11]。本試驗(yàn)首先選取出生后1～23 d的小鼠背部皮膚,包埋后通過(guò)H.E.染色技術(shù)觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),選取出生后3 d、5 d、8 d、13 d、16 d、18 d、20 d 和23 d 的小鼠,其中,3 d、5 d、8 d 毛囊分別處于生長(zhǎng)期;13 d、16 d、18 d 毛囊處于退化期;20 d毛囊處于靜止期;23d毛囊進(jìn)入再生長(zhǎng)期。

IHC-P試驗(yàn)顯示,FGF11表達(dá)于小鼠背部皮膚真皮乳頭、毛基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘和皮脂腺,且在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有表達(dá),有試驗(yàn)證明,FGF11是細(xì)胞內(nèi)蛋白,主要在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合和控制電壓門(mén)控通道,進(jìn)而在某些促有絲分裂和細(xì)胞存活的相關(guān)活動(dòng)中發(fā)揮作用[12]。光密度統(tǒng)計(jì)、RT-PCR、WB結(jié)果均顯示FGF11的表達(dá)量忽高忽低,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)律。表明FGF11對(duì)于出生后小鼠背部皮膚毛囊生長(zhǎng)周期可能沒(méi)有明顯和特定的調(diào)節(jié)作用。不過(guò),在生長(zhǎng)期Ⅲc(5 d)和退化期Ⅲ(16 d),FGF11的表達(dá)量分別高于生長(zhǎng)期和退化期的其他階段,其原因需要今后試驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

IHC-P試驗(yàn)得出,小鼠背部皮膚真皮乳頭、毛基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘、膨大部、皮脂腺和表皮均有FGF13的免疫陽(yáng)性反應(yīng),主要在細(xì)胞質(zhì)中,在膨大部的陽(yáng)性免疫反應(yīng)較強(qiáng),內(nèi)根鞘免疫陽(yáng)性反應(yīng)很弱。RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示,FGF13 mRNA從3 d開(kāi)始一致下降,在13 d表達(dá)量最低,從16 d開(kāi)始表達(dá)量上升。Western Blot試驗(yàn)顯示的FGF13蛋白表達(dá)趨勢(shì)與定量表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)果提示,FGF13在膨大部表達(dá)量高,這與前人所提出的試驗(yàn)結(jié)果一致,而毛囊干細(xì)胞主要位于膨大部,干細(xì)胞以循環(huán)的方式不斷處于活躍和靜止?fàn)顟B(tài),說(shuō)明FGF13對(duì)于毛囊的自我更新有一定的作用;且FGF13在生長(zhǎng)期表達(dá)量較高,退化期表達(dá)量降低,靜止期表達(dá)量增加,再生長(zhǎng)期表達(dá)量又升高,說(shuō)明FGF13可能誘導(dǎo)毛囊從靜止期向再生長(zhǎng)期過(guò)渡,可以促進(jìn)對(duì)毛囊生長(zhǎng),可能的解釋是,毛囊進(jìn)入再生長(zhǎng)期主要取決于自主的、依賴于固有的信號(hào)和非自主的、因周?chē)蟓h(huán)境激活劑傳遞過(guò)來(lái)的信號(hào),而靜止期FGF13信號(hào)增強(qiáng),超過(guò)了毛囊干細(xì)胞活躍的閾值,刺激毛囊干細(xì)胞激活,進(jìn)而進(jìn)入了再生長(zhǎng)期。

FGF18可能誘導(dǎo)真皮乳頭細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子影響毛囊細(xì)胞,或可能會(huì)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞影響血液循環(huán)[13]。Kawano M等人的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)生長(zhǎng)期皮下注射FGF18,基質(zhì)細(xì)胞增殖立刻被抑制,毛囊生長(zhǎng)強(qiáng)烈被抑制。相比之下,當(dāng)靜止期皮下注射FGF18時(shí),沒(méi)有迅速的反應(yīng),但是經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后(3～8周),實(shí)驗(yàn)組毛發(fā)生長(zhǎng)早于對(duì)照組,對(duì)照組皮下注射的是磷酸鹽緩沖溶液[14]。Kimura-Ueki M等人試驗(yàn)敲除FGF18,顯示出靜止期縮短[15]。而且,真皮乳頭的FGF18在靜止期早期表達(dá)量多于晚期。還有研究說(shuō)對(duì)體外膨大部干細(xì)胞FGF18是抑制效應(yīng)。本試驗(yàn)沒(méi)有添加或者敲除FGF18,是研究了毛囊正常發(fā)育過(guò)程中FGF18的表達(dá)情況。IHC-P試驗(yàn)得出,在小鼠背部皮膚真皮乳頭、毛基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘、膨大部、皮脂腺、膨大部和表皮均有FGF18的免疫陽(yáng)性反應(yīng),在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá),但是內(nèi)根鞘陽(yáng)性免疫反應(yīng)物較少,在外根鞘陽(yáng)性反應(yīng)物較高。RT-PCR試驗(yàn)顯示,FGF18 mRNA從3 d表達(dá)量開(kāi)始逐漸降低,到了16 d降到最低,18 d開(kāi)始上升。Western Blot試驗(yàn)顯示,FGF18蛋白表達(dá)趨勢(shì)與定量表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)果提示,FGF18在生長(zhǎng)期期間的表達(dá)量從高到低,退化期表達(dá)量降到最低,靜止期表達(dá)量又增加,再生長(zhǎng)期表達(dá)量高于靜止期,可見(jiàn)由于FGF18信號(hào)的增加,毛囊進(jìn)入了再生長(zhǎng)期,試驗(yàn)得出FGF18在毛囊循環(huán)周期中在靜止期向生長(zhǎng)期過(guò)渡期有一定的作用,可以促使毛囊從靜止期進(jìn)入再生長(zhǎng)期,可能是因?yàn)镕GF18誘導(dǎo)真皮乳頭細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子,影響毛囊細(xì)胞,也可以刺激真皮成纖維細(xì)胞,乳頭細(xì)胞以及表皮角化細(xì)胞的DNA合成。

5 結(jié)論

5.1 通過(guò) NCBI設(shè)計(jì)了小鼠 FGF11、FGF13和FGF18的特異性引物,通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,得到大小分別為109 bp、121 bp、132 bp的基因片段。

5.2 在小鼠毛囊生長(zhǎng)第一個(gè)周期,FGF11可能沒(méi)有明顯和特定的調(diào)節(jié)作用;FGF13可能對(duì)于毛囊的自我更新有一定的作用,誘導(dǎo)毛囊從靜止期向再生長(zhǎng)期過(guò)渡,促進(jìn)毛囊生長(zhǎng);FGF18在毛囊從靜止期向生長(zhǎng)期過(guò)渡期有一定的作用,可以促使毛囊從靜止期進(jìn)入再生長(zhǎng)期。