張吉芳，韓冰，孫國棟

(1 濟南大學·山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250000；2 山東省醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院·山東第一醫(yī)科大學；3 濟寧市疾病預防控制中心)

腦卒中是中老年人群的常見病、多發(fā)病，近年來其發(fā)病率逐年升高并有年輕化趨勢。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，以缺血性腦卒中最常見，占腦卒中總數(shù)的60%～70%。再灌注是治療缺血性腦卒中最基本、最重要的原則，但恢復血液供應后又會發(fā)生再灌注損傷,從而加重腦組織損傷。腦缺血再灌注損傷是一個多步驟、多信號通路參與的復雜病理生理過程，其具體作用機制尚不完全清楚。Wnt/β-catenin信號通路是機體經(jīng)典的保守模式分子信號通路之一，在細胞增殖、分化及免疫耐受等方面具有重要作用[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt/β-catenin信號通路能夠加重腦缺血再灌注損傷[2]，反之激活Wnt/β-catenin信號通路能夠減輕腦缺血再灌注損傷[3]。電針療法是指在刺入人體穴位的毫針上，通以微量低頻脈沖電流的治療方法。研究表明，電針療法能夠增加缺血腦組織的耐受性，促進神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復[4]，但其具體作用機制尚不清楚。2018年6～12月，本研究觀察了電針干預對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠90只，SPF級，3月齡，體質(zhì)量260～290 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠9只；標準飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水；飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度55%～60%，光照12 h明暗交替。G6805-1A型電針儀，上海華誼醫(yī)用儀器廠；VMS-LDF1型激光多普勒血流儀，英國Moor公司。β-catenin、Bcl-2、Bax兔抗鼠多克隆抗體，英國Abcam公司；GAPDH兔抗鼠多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，北京博爾西科技有限公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)，美國Sigma公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，瑞士羅氏公司。

1.2 動物分組與模型制備 所有SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術組、模型組和電針組，每組30只。模型組和電針組采用改良線栓法[5]制作局灶性腦缺血再灌注模型，缺血120 min拔除線栓，恢復大腦中動脈血供。假手術組僅分離血管，不阻閉血流，其余步驟同模型組。電針組縫合手術切口即刻，俯臥位固定于針灸治療臺，采用0.25 mm×25 mm一次性不銹鋼毫針針刺百會穴、大椎穴[6]，并接通G6805-1A型電針儀，頻率為2/15 Hz、波形為疏密波、電流強度為1 mA；每12 h治療1次，每次30 min，共治療5次。假手術組和模型組同期固定于針灸治療臺，但不進行電針治療。

1.3 大鼠行為學觀察 分別于再灌注6、24、48 h，觀察各組肢體活動情況，按Longa法[7]進行神經(jīng)功能缺失評分。

1.4 缺血側(cè)局部腦血流量和血流速度檢測 各組再灌注48 h，3%水合氯醛麻醉，充分暴露缺血側(cè)顱骨，在距矢狀縫2 mm、冠狀縫下3 mm處，用骨鉆充分暴露軟腦膜，將激光多普勒血流儀探頭固定于軟腦膜上，記錄缺血側(cè)局部腦血流量和血流速度。

1.5 腦梗死體積檢測 檢測完缺血側(cè)局部腦血流量和血流速度，每組隨機選取10只，斷頭處死，完整取出腦組織，均勻切成5片冠狀切片，浸入2% TTC溶液，37 ℃避光染色30 min，4%多聚甲醛固定24 h，高清數(shù)碼相機同樣光性條件下拍照。正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈蒼白色。采用Image J軟件測量腦梗死面積，計算腦梗死體積。腦梗死體積=各層梗死面積總和×層間隔。為消除腦水腫造成的誤差，采用校正腦梗死體積進行計算[8]。校正腦梗死體積=健側(cè)大腦半球體積-(患側(cè)大腦半球體積-患側(cè)大腦半球梗死體積)。腦梗死體積百分比=校正腦梗死體積/健側(cè)大腦半球體積×100%。

1.6 神經(jīng)細胞凋亡率檢測 再灌注48 h，每組隨機選取10只，斷頭處死，完整取出缺血側(cè)腦皮質(zhì)，常規(guī)制作石蠟切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蛋白酶K室溫孵育、微波加熱修復抗原，按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明染色，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。光鏡下凋亡細胞的細胞核呈棕褐色或棕黃色。每張切片隨機選取10個400倍不重疊視野，計數(shù)每視野陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算神經(jīng)細胞凋亡率。

1.7 腦組織β-catenin、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。再灌注48 h，將每組剩余大鼠斷頭處死，迅速完整取出腦組織，分離缺血區(qū)腦組織，置于-80 ℃冰箱保存。取凍存組織50 mg，RIPA裂解液充分裂解，取上清液，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。然后加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白50 μg，10% SDS-PAGE(5%濃縮膠、10%分離膠)分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入β-catenin、Bcl-2、Bax和GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光,暗室中顯影、定影。采用Quantity One軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與GAPDH蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組行為學觀察 再灌注48 h，假手術組無神經(jīng)功能缺損癥狀，可正常活動；模型組存在明顯的肢體活動障礙，而電針組肢體活動障礙較模型組明顯減輕。各組再灌注不同時間神經(jīng)功能缺失評分比較見表1。

表1 各組再灌注不同時間神經(jīng)功能缺失評分比較(分，

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 各組缺血側(cè)局部腦血流量和血流速度比較 見表2。

表2 各組缺血側(cè)局部腦血流量和血流速度比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 各組腦梗死體積百分比和神經(jīng)細胞凋亡率比較 見表3。

表3 各組腦梗死體積百分比和神經(jīng)細胞凋亡率比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 各組腦組織β-catenin、Bcl-2、Bax蛋白表達比較 見表4。

表4 各組腦組織β-catenin、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

腦卒中是導致人類致殘和致死的主要疾病之一，其中約85%為缺血性腦卒中。近年隨著人民生活方式轉(zhuǎn)變和人口老齡化加劇，缺血性腦卒中的發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢[9]。重建血流或增強缺血區(qū)血流供應是缺血腦組織修復損傷的重要條件，但血流再灌注后腦組織損傷卻進一步加重，其作用機制目前尚不完全清楚，亦無較好的治療方法。因此，如何有效減輕腦缺血再灌注損傷已成為缺血性腦卒中治療的關鍵。

針灸是中醫(yī)學傳統(tǒng)療法之一，目前已在國際上得到廣泛認可。電針是傳統(tǒng)針灸技術的延伸，在傳統(tǒng)針灸經(jīng)絡理論的基礎上結合了現(xiàn)代電療技術，在針具上加以與人體生物電相似的微量低頻脈沖電流，針與電兩種刺激相結合，從而更好地調(diào)理經(jīng)絡之氣。Liu等[10]在一項薈萃分析中證實，缺血性腦卒中給予電針干預能夠明顯改善患者運動功能?，F(xiàn)代醫(yī)學已證實，對于腦缺血、癡呆、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，百會穴、大椎穴是針刺治療的首選穴位[11,12]；鄭德松等[13]研究亦發(fā)現(xiàn)，針刺百會穴、大椎穴能夠明顯改善缺血性腦卒中患者平衡功能，提高康復訓練效果。但目前對其具體作用機制尚不清楚。

本研究通過改良線栓法建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，與假手術組比較，模型組腦血流量和血流速度均明顯降低，神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死面積百分比均明顯上升，提示局灶性腦缺血再灌注損傷模型制備成功。電針組于造模結束后給予電針百會穴和大椎穴干預，結果發(fā)現(xiàn)，其腦血流量和血流速度較模型組均明顯升高，神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死面積百分比較模型組明顯下降，提示電針干預能夠明顯提高局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦血流量，減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能。

神經(jīng)細胞大量凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要表現(xiàn)之一。腦組織損傷后，組織細胞同時啟動凋亡程序和抑制凋亡程序。目前已知參與細胞凋亡程序的因子較多，研究最多的是Bcl-2家族成員，如促進細胞凋亡的Bax和抑制細胞凋亡的Bcl-2。Bax自身可形成同源二聚體，與細胞內(nèi)相關蛋白結合后激活Caspase主導的級聯(lián)反應，從而導致細胞凋亡[14]。Bcl-2能競爭性結合Bax形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡。因此，Bax/Bc1-2是決定細胞凋亡的重要因素，可用來衡量神經(jīng)細胞損傷程度[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組神經(jīng)細胞凋亡率明顯升高，腦組織Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低；而電針組神經(jīng)細胞凋亡率及腦組織Bax蛋白表達較模型組明顯降低，Bcl-2蛋白表達較模型組明顯升高。提示電針干預能夠通過抑制神經(jīng)細胞凋亡來減輕腦缺血再灌注損傷。

Wnt/β-catenin信號通路是抑制細胞凋亡和促進細胞存活的重要信號轉(zhuǎn)導通路[16]。β-catenin是該通路中的一個關鍵作用位點，廣泛存在于各種細胞中。既往研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在腦缺血再灌注損傷中具有重要的調(diào)控作用[17]。已有研究證實，激活Wnt/β-catenin信號通路能夠明顯減輕腦缺血再灌注損傷，促進神經(jīng)功能恢復[18～20]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組腦組織β-catenin蛋白表達明顯降低；而電針組β-catenin蛋白表達較模型組明顯增高。提示電針干預能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路減輕腦缺血再灌注損傷。

綜上所述，電針干預對大鼠腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用，其作用機制與激活Wnt/β-catenin信號通路及抑制Bax蛋白表達、促進Bcl-2蛋白表達有關。