錢偉明，王海燕，李可

(常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院，江蘇常州213161)

結(jié)腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率在我國(guó)呈明顯上升趨勢(shì)，已成為當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重危脅居民健康的疾病之一[1]。結(jié)腸癌早期常無(wú)明顯癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，即使能夠手術(shù)，也易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，患者5年生存率較低[2，3]。但目前對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病的分子機(jī)制仍不十分清楚。Ras超家族是真核生物中普遍存在的一類小分子GTP結(jié)合蛋白，通過介導(dǎo)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和多種細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等生物學(xué)過程[4]。Ras超家族許多成員是癌基因，其基因突變或蛋白異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤形成[5,6]。Ras蛋白特異性鳥苷酸釋放因子1(RASGRF1)是Ras蛋白的上游信號(hào)分子之一，能夠調(diào)控Ras蛋白表達(dá)。Deng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1可作為星形細(xì)胞瘤的治療靶點(diǎn)之一。甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式，特定基因的甲基化可作為惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志[8]。有研究證實(shí)，RASGRF1異常甲基化與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[9]。但目前鮮見RASGRF1蛋白表達(dá)及其基因甲基化狀態(tài)與結(jié)腸癌關(guān)系的報(bào)道。為此，我們進(jìn)行了本研究，旨在探討RASGRF1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2017年12月常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院收治的初診結(jié)腸癌患者81例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷；②初診，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并嚴(yán)重影響免疫組化或甲基化特異性PCR(MSP)檢查結(jié)果的疾病者；③結(jié)腸癌組織邊界不清，難以取得癌旁非腫瘤組織者；④臨床病理資料不完整者。其中，男55例、女26例，年齡29～81歲(<50歲19例、≥50歲62例)；腫瘤直徑：<4 cm 38例，≥4 cm 43例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例；組織分化程度：高分化9例，中分化37例，低分化35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。本研究經(jīng)常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

江蘇是一個(gè)經(jīng)濟(jì)大省，又是一個(gè)水利大省。江蘇的經(jīng)濟(jì)社會(huì)現(xiàn)代化發(fā)展，不僅需要水利提供更高標(biāo)準(zhǔn)的防洪安全保障，還需要提高水資源和水生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)支撐，以水利的現(xiàn)代化支撐和保障經(jīng)濟(jì)社會(huì)的現(xiàn)代化發(fā)展。

1.2 RASGRF1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)，常規(guī)石蠟包埋，10 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)65 ℃烤片3 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。Tris-EDTA抗原修復(fù)液(pH 9.0)煮沸以修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫。PBS沖洗5 min×3次，3% H2O2避光孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗5 min×3次，10%正常羊血清封閉10 min，加入兔抗人RASGRF1一抗，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗5 min×3次，加入酶標(biāo)抗兔聚合物二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知RASGRF1抗原陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

通過對(duì)教學(xué)知識(shí)點(diǎn)及技能點(diǎn)的分析梳理，結(jié)合電商職業(yè)技能鑒定要求，擬建實(shí)踐教學(xué)基地建筑面積約200平方米，按照企業(yè)實(shí)際電商工作場(chǎng)景，引入企業(yè)真實(shí)工作沒項(xiàng)目，設(shè)置4個(gè)電商(商務(wù)秘書)職業(yè)場(chǎng)景實(shí)驗(yàn)室，細(xì)分為19個(gè)具體項(xiàng)目，配置76個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作位，并依據(jù)企業(yè)真實(shí)項(xiàng)目靈活調(diào)整，以培養(yǎng)學(xué)生電商(商務(wù)秘書)實(shí)踐應(yīng)用和創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力為目標(biāo)，將企業(yè)真實(shí)工作項(xiàng)目融入電商實(shí)踐課程。使教學(xué)內(nèi)容具體化、任務(wù)化、場(chǎng)景化。每個(gè)項(xiàng)目任務(wù)都是電商(商務(wù)秘書)一項(xiàng)場(chǎng)景實(shí)驗(yàn)室系列學(xué)習(xí)任務(wù)，教學(xué)內(nèi)容安排圍繞電商場(chǎng)景實(shí)驗(yàn)室任務(wù)來完成。

采用雙盲法由兩位病理科高年資醫(yī)師獨(dú)立閱片。RASGRF1蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色至棕褐色，顆粒狀。每張切片隨機(jī)選取4個(gè)400倍不重疊視野，每視野計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，評(píng)價(jià)染色強(qiáng)度，并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：≤5%為0分，>5%～33%計(jì)1分，>33%～66%計(jì)2分，>66%為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分綜合評(píng)價(jià)，二者乘積≥2為RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

2018年4月4日至5日西寧市嚴(yán)重污染天氣特征分析 馬學(xué)蓮 張青梅 馬海超 甘 璐 馬 麗 朱宇蓉 (4-176)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 RASGRF1基因甲基化檢測(cè) 采用MSP法。取手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織，按Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit說明提取組織DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取組織DNA 2 μg，加入去離子水稀釋至50 μL，與3 mol/L氫氧化鈉溶液5.5 μL混勻，37 ℃水浴30 min；加入10 mmol/L氫醌30 μL，輕輕震蕩混勻；再加入3.6 mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)520 μL，輕輕震蕩混勻；-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ幸镉缮虾ｃ懖┥锟萍加邢薰驹O(shè)計(jì)合成。甲基化特異性引物：上游引物5′-TTGGACGTTTTTTGTAGTTTTATTTC-3′，下游引物5′-CCCGAAAATTTACGTCTTTACG-3′；非甲基化特異性引物：上游引物5′-TGGATGTTTTTGTAGTTTTATTTTGT-3′，下游引物5′-CATCCCAAAAATTTACATCTTTACAC-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×HotStar Taq PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix 2 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，去離子水11 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳分離甲基化與非甲基化條帶，采用凝膠成像儀于紫外線下拍照分析。結(jié)果判定：電泳結(jié)果中出現(xiàn)甲基化條帶伴或不伴非甲基化條帶擴(kuò)增，判定為甲基化；電泳結(jié)果中僅出現(xiàn)非甲基化條帶擴(kuò)增，而未出現(xiàn)甲基化條帶擴(kuò)增，判定為非甲基化。

2 結(jié)果

2.3 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)及其基因甲基化陽(yáng)性與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)；結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見表1。

RASGRF1基因是一種Ras蛋白激活因子，定位于人染色體25q15，長(zhǎng)6 313 bp。RASGRF1是一種父系印記基因，其編碼的RASGRF1蛋白能促進(jìn)Ras蛋白從Ras-GDP復(fù)合體中解離，進(jìn)而與GTP結(jié)合形成Ras-GTP，從而激活特定的Ras信號(hào)通路。研究證實(shí)，RASGRF1能夠激活的Ras蛋白有K-Ras、H-Ras、N-Ras[12,13]。RASGRF1蛋白還可經(jīng)DHPH2介導(dǎo)直接與微管相連[11]，繼而參與細(xì)胞的諸多生物學(xué)過程。由于RASGRF1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)較高，目前關(guān)于RASGRF1蛋白的研究主要集中在中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中亦具有重要作用[15,16]。Zhu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1蛋白可參與調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶生成，從而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；Sacco等[16]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，RASGRF1相關(guān)的衍生肽均可通過抑制Ras蛋白，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織；結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無(wú)關(guān)。結(jié)果表明，RASGRF1蛋白在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，其低表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.1 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織RASGRF1蛋白表達(dá)與基因甲基化比較 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為37.04%(30/81)、91.36%(74/81)，RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性率分別為70.37%(57/81)、18.52%(15/81)。結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織(χ2=51.995，P<0.01)，RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織(χ2=44.100，P<0.01)。

表1 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)及其基因甲基化陽(yáng)性與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

近年來，盡管我國(guó)臨床診療水平有了明顯提高，但受居民飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣、環(huán)境變化等因素影響，結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率并未呈現(xiàn)出全球范圍內(nèi)的下降趨勢(shì)，反而呈上升趨勢(shì)[10]。中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)結(jié)腸癌新發(fā)病例37.6萬(wàn)、死亡病例19.1萬(wàn)，其發(fā)病率和病死率均居所有惡性腫瘤的第5位[11]。目前對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病的具體分子機(jī)制仍不十分清楚。因此，探索與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制具有重要意義。

2.2 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白表達(dá)與RASGRF1基因甲基化的關(guān)系 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(ρ=-0.486，P<0.05)。

表觀遺傳學(xué)在基因表達(dá)的相關(guān)調(diào)控機(jī)制中具有重要作用。其中，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的主要方式之一。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶第5位碳原子上，從而形成5-甲基胞嘧啶[17]。編碼蛋白質(zhì)基因的高甲基化狀態(tài)能直接阻礙基因轉(zhuǎn)錄，一般認(rèn)為DNA非甲基化與基因活化相關(guān)，而DNA甲基化則與基因沉默相關(guān)，異常的DNA甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)異常。不同于基因突變等不可逆的經(jīng)典遺傳學(xué)現(xiàn)象，DNA甲基化是一種可逆的動(dòng)態(tài)過程，去甲基化基因可恢復(fù)其活性。因此，將異常甲基化的抑癌基因或促癌基因去甲基化有可能抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1基因異常甲基化不僅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如腦外傷昏迷、癲癇發(fā)作等[19，20]，還可參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。如Klose等[8]研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1基因甲基化異常升高可增加人群罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織；結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無(wú)關(guān)。表明RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Konstantinopoulos等[32]通過研究證實(shí)，SAHA聯(lián)合聚PARP抑制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的協(xié)同作用可能與DNA的同源重組相關(guān)。同源重組DNA修復(fù)途徑中，成員發(fā)生頻繁的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變是漿液性上皮性卵巢癌的特征是，多數(shù)存在不同程度的同源重組修復(fù)缺陷。PARP抑制劑是針對(duì)同源重組缺陷腫瘤的靶向治療藥物，而對(duì)具有完整同源重組途徑的上皮性卵巢癌治療作用差。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAHA處理后的巢癌細(xì)胞中同源重組途徑的相關(guān)基因RAD51和BRCA1表達(dá)下調(diào)，并且在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中都能夠增加PARP抑制劑對(duì)于卵巢癌細(xì)胞的毒性作用，證實(shí)SAHA的抗腫瘤機(jī)制與DNA的同源重組關(guān)系密切[32]。

為進(jìn)一步確定RASGRF1基因甲基化狀態(tài)與其編碼蛋白表達(dá)的關(guān)系，本研究分析了結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與RASGRF1基因甲基化陽(yáng)性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。說明結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化異常升高是RASGRF1蛋白表達(dá)下降的重要原因。進(jìn)一步推斷RASGRF1基因去甲基化可能是未來結(jié)腸癌治療的研究方向之一。

綜上所述，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白低表達(dá)、RASGRF1基因甲基化異常升高，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且均與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。