周偉青，王修銀，劉道利，王小英，江桂英

(廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣州510130)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種無過量飲酒史，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為特征的臨床病理綜合征，雖然通常被認(rèn)為是一種良性病變，但可在較短期內(nèi)發(fā)展為不可逆性肝損害，其肝纖維化發(fā)生率高達(dá)25%，且1.5%～8.0%患者可進(jìn)展為肝硬化[1]。NAFLD的病因和發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制是“二次打擊”學(xué)說。肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積形成單純性脂肪肝，造成“初次打擊”，在此基礎(chǔ)上氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體和肝細(xì)胞本身的持續(xù)損傷和炎癥形成，即為“二次打擊”，從而促進(jìn)了肝纖維化或肝硬化的發(fā)生、發(fā)展。在“二次打擊”過程中，胰島素抵抗(IR)貫穿始終[2～4]。茵陳蒿湯是由茵陳蒿、梔子和大黃組成的復(fù)方制劑。有研究證實(shí)，茵陳蒿湯能夠改善脂代謝紊亂，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，具有調(diào)脂保肝作用[5]。但其對(duì)合并IR的NAFLD是否有效尚不清楚。2018年2月～2019年3月，本研究觀察了茵陳蒿湯對(duì)NAFLD伴IR大鼠的肝保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD大鼠120只，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量150～180 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，4只一籠。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。茵陳蒿湯方藥組成：茵陳蒿18 g、梔子12 g、大黃6 g，由廣東一方制藥廠生產(chǎn)的茵陳蒿、梔子、大黃單味藥濃縮顆粒劑組配，其顆?！蒙幏謩e為1∶17、1∶14、1∶3。r-911型全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀，中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司；AU5800型全自動(dòng)生化分析儀，美國貝克曼庫爾特公司；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、愛帕琳肽(Apelin)、內(nèi)脂素(Visfatin)以及網(wǎng)膜素(Omentin) ELISA試劑盒，武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組處理 所有SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、辛伐他汀組和茵陳蒿湯低、中、高劑量組，每組20只。模型組、辛伐他汀組和茵陳蒿湯低、中、高劑量組參照文獻(xiàn)[6，7]方法建立NAFLD伴IR模型，即普通飼料+10%果糖水喂養(yǎng)6周；第7周開始，模型組給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，辛伐他汀組給予辛伐他汀200 mg/kg灌胃，茵陳蒿湯低、中、高劑量組分別給予茵陳蒿湯20、30、40 g/kg灌胃，連續(xù)4周，期間繼續(xù)普通飼料+10%果糖水喂養(yǎng)。對(duì)照組普通飼料+蒸餾水喂養(yǎng)。

1.3 血生化指標(biāo)檢測(cè) 末次灌胃結(jié)束，眶后靜脈叢取血，3 500 r/min離心5 min，取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)；葡萄糖灌胃2 h，眶后靜脈叢再次取血，檢測(cè)糖負(fù)荷2 h血糖(2 h PG)。各組處死前15 min，眶后靜脈叢取血，3 500 r/min離心5 min，取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝損傷指標(biāo)[血清谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、ALT、AST活性]、脂肪肝病變指標(biāo)[血清膽堿酯酶(ChE)活性]以及脂代謝指標(biāo)[血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、游離脂肪酸(FFA)]；采用ELISA法檢測(cè)肝臟纖維化指標(biāo)(TGF-β1、TNF-α)、脂肪因子指標(biāo)(Apelin、Visfatin、Omentin)；采用放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素(Fins)，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。ISI=ln [1/(Fins×FPG)]。

1.4 肝組織病理學(xué)改變和纖維化程度評(píng)估 各組禁食12 h，20%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉后稱體質(zhì)量，脫臼處死，快速分離肝組織，肉眼觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變，濾紙吸干后稱肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。取各組相同部位肝組織，中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。HE染色，顯微鏡下評(píng)估肝組織病理學(xué)評(píng)分；Masson染色，顯微鏡下評(píng)估肝纖維化程度評(píng)分。肝組織病理學(xué)評(píng)分：正常肝臟記0分，膠原增多但無間隔產(chǎn)生記1分，有不完全間隔形成記2分，有完全間隔形成但間隔較細(xì)記3分，有較厚的完全間隔形成記4分。肝纖維化程度評(píng)分：肝組織內(nèi)除中心靜脈及匯管區(qū)周圍外不見纖維組織記1分，出現(xiàn)少量散在纖維分布記2分，出現(xiàn)大量纖維組織并呈網(wǎng)格狀分布記4分，介于二者之間記3分。

2 結(jié)果

2.1 各組血清肝損傷、脂肪肝病變、糖脂代謝指標(biāo)比較 見表1、2。

表1 各組血清GST、ALT、AST、ChE活性比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，△P<0.05；與茵陳蒿湯低劑量組比較，▲P<0.05；與茵陳蒿湯中劑量組比較，▽P<0.05。

表2 各組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，△P<0.05；與茵陳蒿湯低劑量組比較，▲P<0.05；與茵陳蒿湯中劑量組比較，▽P<0.05。

2.2 各組肝纖維化指標(biāo)和脂肪因子水平比較 見表3。

表3 各組血清TGF-β1、TNF-α、Apelin、Visfatin、Omentin水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，△P<0.05；與茵陳蒿湯低劑量組比較，▲P<0.05；與茵陳蒿湯中劑量組比較，▽P<0.05。

2.3 各組血清FPG、2 h PG、Fins水平和ISI比較 見表4。

表4 各組血清FPG、2 h PG、Fins水平和ISI比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，△P<0.05；與茵陳蒿湯低劑量組比較，▲P<0.05；與茵陳蒿湯中劑量組比較，▽P<0.05。

2.4 各組肝組織病理學(xué)變化 對(duì)照組肝細(xì)胞大小均勻，形態(tài)及分布正常，肝索結(jié)構(gòu)呈放射狀排列。模型組肝細(xì)胞排列紊亂并腫脹，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，基本無放射狀排列，纖維結(jié)締組織增生明顯，且肝細(xì)胞內(nèi)可見脂滴空泡，細(xì)胞核偏移明顯，匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，辛伐他汀組肝纖維化程度明顯減輕，匯管區(qū)僅見少量纖維結(jié)締組織增生和炎性細(xì)胞浸潤，假小葉形成不明顯，肝細(xì)胞脂肪變性程度較輕。茵陳蒿湯低、中、高劑量組上述病理變化均有不同程度改善，且有隨著茵陳蒿湯劑量增加，上述病理變化改善越來越明顯。各組肝臟指數(shù)及肝組織病理學(xué)評(píng)分、肝纖維化程度評(píng)分比較見表5。

表5 各組肝臟指數(shù)及肝組織病理學(xué)評(píng)分、肝纖維化程度評(píng)分比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，△P<0.05；與茵陳蒿湯低劑量組比較，▲P<0.05；與茵陳蒿湯中劑量組比較，▽P<0.05。

3 討論

NAFLD是指除乙醇和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。雖然脂肪肝被認(rèn)為是一種良性病變，但它是許多慢性肝臟疾病的早期階段，不經(jīng)治療的脂肪肝會(huì)逐漸發(fā)展為肝纖維化，并可引起肝細(xì)胞癌變[8～10]。在本研究中，模型組經(jīng)過長期普通飼料+高糖飲水建模后，病理結(jié)果顯示肝細(xì)胞體積增大,胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，細(xì)胞核居中或偏位，肝竇受壓變窄，并出現(xiàn)纖維化病變，提示成功建立了NAFLD模型。血清GST、AST、ALT及ChE活性是反映肝損傷的重要指標(biāo)，其中AST、ALT能反映肝細(xì)胞膜的完整性。與對(duì)照組相比，模型組血清GST、AST、ALT、ChE活性明顯升高，提示肝功能明顯受損，而辛伐他汀組和茵陳蒿湯各劑量組血清上述指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度下降，證實(shí)茵陳蒿湯具有肝保護(hù)作用。

肝臟是維持糖代謝穩(wěn)態(tài)與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要器官。在“二次打擊”學(xué)說中，IR及脂代謝失衡被認(rèn)為是關(guān)鍵致病因素。IR可導(dǎo)致肝糖原分解增加，外周組織糖利用減少，血糖升高，糖毒性和脂毒性均可加重肝損傷及IR，從而形成惡性循環(huán)[11，12]。IR是由于機(jī)體葡萄糖調(diào)節(jié)功能下降，導(dǎo)致機(jī)體通過代償分泌更多胰島素，該現(xiàn)象又可引起機(jī)體TC水解及血清FFA水平升高，最終導(dǎo)致血糖升高[13，14]。同時(shí)，IR使胰島素?zé)o法高效地抑制脂肪酶活性，這種酶活性增高會(huì)導(dǎo)致機(jī)體大量脂肪被分解，并經(jīng)肝門靜脈進(jìn)入肝內(nèi)，形成脂肪肝，而在氧化應(yīng)激相關(guān)的脂質(zhì)過氧化及炎性因子作用下，會(huì)導(dǎo)致三酰甘油含量增加，進(jìn)一步導(dǎo)致肝功能損傷[15]。Lagathu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，過多的FFA可通過增加胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3，加重IR。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組FPG、Fins水平明顯升高，ISI明顯降低；同時(shí)，模型組血清TC、TG、LDL-C、FFA水平明顯上升，而血清HDL-C水平明顯下降。提示模型組出現(xiàn)了糖脂代謝紊亂及IR。而茵陳蒿湯能夠降低血糖，明顯提高ISI，改善IR并調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，且這種作用具有一定量效關(guān)系。這可能是茵陳蒿湯保護(hù)NAFLD伴IR大鼠肝功能損傷的重要途徑。

Omentin是一種由網(wǎng)膜脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)，可促進(jìn)脂肪細(xì)胞胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取，胰島素受體后信號(hào)通路中的蛋白激酶B磷酸化，從而提高脂肪細(xì)胞胰島素的敏感性[17]。脂肪因子Visfatin和Apelin對(duì)維持體內(nèi)糖代謝具有重要作用，其水平升高可誘發(fā)IR，使FPG水平升高[18，19]。本研究結(jié)果顯示，茵陳蒿湯與辛伐他汀均可明顯降低NAFLD伴IR大鼠脂肪因子Visfatin、Apelin水平，提高Omentin水平。這表明茵陳蒿湯可能是通過改善脂肪因子水平而改善NAFLD伴IR大鼠的IR。

此外，本研究還觀察了各組血清TGF-β1、TNF-α水平。TGF-β1是公認(rèn)的致纖維化因子，而TNF-α水平則表征組織炎性反應(yīng)程度。TNF-α具有直接的細(xì)胞毒性作用，能夠產(chǎn)生大量氧自由基(ROS)，導(dǎo)致線粒體功能受損，線粒體內(nèi)ROS增多能夠使肝細(xì)胞對(duì)TNF-α損傷的敏感性升高，最終引發(fā)肝細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血清TGF-β1、TNF-α水平均明顯上升，HE染色和Masson染色結(jié)果亦顯示，其纖維化程度和炎性浸潤程度亦隨之增加，而茵陳蒿湯各劑量組和辛伐他汀組肝纖維化程度和炎性細(xì)胞浸潤程度均有不同程度降低，且隨著茵陳蒿湯劑量增加，其效果越來越明顯。提示茵陳蒿湯可通過降低血清TGF-β1及TNF-α水平，減輕肝組織纖維化程度和炎性細(xì)胞浸潤程度。這一結(jié)果與茵陳蒿湯對(duì)酒精性脂肪肝的保護(hù)作用類似[21]。

綜上所述，茵陳蒿湯能夠劑量依賴性地改善NAFLD伴IR大鼠糖脂代謝，進(jìn)而減輕肝臟脂肪病變，緩解肝纖維化程度；其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂肪因子水平、降低IR、改善糖脂代謝紊亂，從而逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞損傷有關(guān)。