李超，王輝，洪建，孟松，邵永，朱孝成

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇徐州221006)

胃癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。根治性手術(shù)切除是目前惟一能夠治愈胃癌的手段，但由于胃癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，無法進(jìn)行根治性手術(shù)，即使可以手術(shù)切除，也易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差[2]。因此，迫切需要闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制，以便尋找理想的早期診斷標(biāo)志物以及高效特異的治療靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，不具有蛋白質(zhì)編碼功能，但可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA還可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)過程。H19是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的lncRNA，長度為2.3 kb，在胚胎組織中高表達(dá)，在成年組織中一般不表達(dá)，但在腫瘤發(fā)生時(shí)被重新激活。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞lncRNA H19高表達(dá)，其高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲并抑制其凋亡[4]。微小RNA(miRNA)是一類在進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，可參與人類近1/3基因的表達(dá)調(diào)控，在發(fā)育時(shí)序控制、細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控等方面具有重要作用[5]。miR-141是miR-200家族的成員之一，在上皮性卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[6，7]，其在惡性腫瘤中的生物學(xué)效應(yīng)可能具有雙向性。目前臨床上關(guān)于胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。為此，我們觀察了胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達(dá)變化，并分析其表達(dá)變化與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2015年12月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的胃癌患者81例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胃癌診斷；②初診；③采用根治性或姑息性手術(shù)切除，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤、全身感染性疾病以及肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者；②術(shù)前接受任何抗腫瘤治療者；③臨床病理資料或隨訪資料不完整者。其中，男57例、女24例，年齡20～70歲(<60歲47例、≥60歲34例)；腫瘤直徑：>5 cm 41例，≤5 cm 40例；浸潤深度：黏膜下各層33例，漿膜層48例；組織分化程度：低分化30例，中高分化51例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期56例，Ⅲ、Ⅳ期25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA H19、miR-141表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。取手術(shù)切除的胃癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm)，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA完整，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按LightCycler 480 SYBRGreen Ⅰ Master說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。lncRNA H19上游引物5′-ACCACTGCACTACCTGACTC-3′，下游引物5′-CCGCAGGGGGTGGCCATGAA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。miR-141上游引物5′-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按試劑盒說明配制PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 15 s共45個(gè)循環(huán)。以GAPDH或U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后采用電話或門診等方式定期隨訪，每2個(gè)月隨訪1次，隨訪截至2018年12月31日，隨訪時(shí)間1～60個(gè)月，統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后生存時(shí)間和術(shù)后5年生存率。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA H19、miR-141表達(dá)比較 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量分別為6.25±2.31、1.06±0.21，miR-141相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.13、1.01±0.19。胃癌組織lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，miRNA-141相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.01)。

2.2 胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量與腫瘤直徑、浸潤深度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、組織分化程度無關(guān)(P均>0.05)；胃癌組織miR-141相對(duì)表達(dá)量與腫瘤直徑、組織分化程度、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織lncRNA H19表達(dá)與miR-141表達(dá)的關(guān)系 以胃癌組織lncRNA H19或miR-141相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為界，將患者分為lncRNA H19、miR-141低表達(dá)者與高表達(dá)者。其中，lncRNA H19低表達(dá)者40例、高表達(dá)者41例，miR-141低表達(dá)者39例、高表達(dá)者42例。lncRNA H19高表達(dá)者中，miR-141低表達(dá)者31例、高表達(dá)者10例；lncRNA H19低表達(dá)者中，miR-141低表達(dá)者8例、高表達(dá)者32例。Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量與miR-141相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.954，P<0.05)。

2.4 胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，lncRNA H19高表達(dá)者與低表達(dá)者術(shù)后生存時(shí)間分別為(28.00±3.20)、(44.00±8.70)個(gè)月，術(shù)后5年生存率分別為26.83%(11/41)、50.0%(20/40)，二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/χ2分別為11.037、4.601，P均<0.05)；miR-141高表達(dá)者與低表達(dá)者術(shù)后生存時(shí)間分別為(46.00±11.33)、(27.00±3.12)個(gè)月，術(shù)后5年生存率分別為50.00%(21/42)、25.60%(10/39)，二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/χ2分別為10.118、4.189，P均<0.05)。

3 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程[8]，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。由于胃癌早期癥狀不典型，多數(shù)患者出現(xiàn)明顯癥狀就診時(shí)已屬中晚期，錯(cuò)過了最佳根治性手術(shù)時(shí)機(jī)，即使可以手術(shù)切除，術(shù)后也極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差[9]。因此，迫切需要闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制，以便尋找更理想的早期診斷標(biāo)志物以及高效特異的治療靶點(diǎn)。

近年隨著基因組測序技術(shù)不斷發(fā)展，越來越多沒有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA被發(fā)現(xiàn)，這些非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[10，11]。目前，臨床研究最多的非編碼RNA是lncRNA和miRNA，它們?cè)谡{(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著不可替代的作用[12]。

lncRNA H19是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的lncRNA，定位于人染色體11p5.5，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，可在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌組織lncRNA H19表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)變化與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[14～17]。近年研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞lncRNA H19高表達(dá)，其高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織；胃癌組織lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量與腫瘤直徑、浸潤深度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、組織分化程度無關(guān)。以上結(jié)果表明，lncRNA H19在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有促癌作用，并且其表達(dá)上調(diào)與胃癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19高表達(dá)者術(shù)后生存時(shí)間和術(shù)后5年生存率均明顯低于lncRNA H19低表達(dá)者，表明lncRNA H19有可能作為胃癌預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

miRNA是一類高度保守的非編碼小分子RNA，作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控元件，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，有可能成為腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[19～21]。miR-141定位于人染色體12p13.31，是miR-200家族的成員之一。miR-141在不同惡性腫瘤中的表達(dá)不盡相同[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中miR-141低表達(dá)，低表達(dá)的miR-141能夠通過靶向調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子4，從而發(fā)揮抑癌作用[23]；而在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-141高表達(dá)，高表達(dá)的miR-141可通過靶向調(diào)控PHLPP1、PHLPP2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[24]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織miR-141相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織；胃癌組織miR-141相對(duì)表達(dá)量與腫瘤直徑、組織分化程度、TNM分期有關(guān)，與患者性別、年齡、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。以上結(jié)果表明，miR-141在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有抑癌作用，并且其表達(dá)下調(diào)與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-141低表達(dá)者術(shù)后生存時(shí)間和術(shù)后5年生存率均明顯低于miR-141高表達(dá)者，表明miR-141同樣有可能作為胃癌預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織lncRNA H19相對(duì)表達(dá)量與miR-141相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示lncRNA H19與miR-141可能存在相互調(diào)控關(guān)系，共同影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但lncRNA H19與miR-141如何共同調(diào)控胃癌的發(fā)生、發(fā)展尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，胃癌組織lncRNA H19高表達(dá)、miR-141低表達(dá)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有可能成為胃癌診斷和預(yù)后判斷的潛在生物標(biāo)志物。但由于本研究樣本量相對(duì)較少、隨訪時(shí)間相對(duì)較短，結(jié)果可能存在偏倚，今后需擴(kuò)大樣本量、增加隨訪時(shí)間進(jìn)一步驗(yàn)證。