夏倩倩 趙 晴 孫樂樂 于功奇 楊 青 王廣進吳 梅 劉永霞 陳聲利 孫勇虎 劉 紅 張福仁

毛囊角化病于1889年由Darier首次命名，故又稱Darier病(Darier’s disease, DD)，是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，人群發(fā)病率在1/30000到1/100000之間[1]。臨床表現(xiàn)為覆有油膩性結(jié)痂的毛囊性丘疹，有時可伴有惡臭和瘙癢，好發(fā)于腹股溝、腋下等皮膚脂溢部位，部分患者也可累積掌跖。DD常在青春期發(fā)病，日曬、高溫、潮濕可加重病情[2]。1993年Craddock等[3]對英國的DD家系進行連鎖分析，首次將該病的致病基因定位于染色體12q23-24.1，1999年Sakuntabhai等[4]將DD致病基因定位于12q23-24.1上編碼肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子-ATP酶2(SERCA2)的ATP2A2基因。目前為止，研究者已在不同家系或散發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)了250多種不同的ATP2A2基因突變(http://lovd.nl/ATP2A2)，其突變類型多樣，以錯義突變最為常見[5]。在本研究中，我們收集了1家系及3例散發(fā)DD患者，通過PCR擴增和Sanger直接測序法對ATP2A2基因進行突變檢測，并對已報道的ATP2A2基因突變進行了文獻回顧。

1 對象與方法

1.1 研究對象 在山東省皮膚病醫(yī)院皮膚科門診，收集經(jīng)臨床及組織病理確診的1家系及3例散發(fā)DD患者。

家系1共3代人，患者3例，其中男1例、女2例(圖1)。先證者(I1)男，67歲，自16歲開始頭、頸、背部及四肢開始出現(xiàn)淺褐色油膩性角化性丘疹，伴癢，夏季嚴重，皮損漸重，融合成片，因搔抓后出現(xiàn)疣狀增生，甚至破潰、滲出,結(jié)痂(圖2a)。其女(II2)，與先證者臨床表現(xiàn)相似(圖2b)；其外孫女 (III1)，病情較輕，在頸部、腹部、下肢散見質(zhì)實小丘疹(圖2c)。

散發(fā)患者S1：女，53歲；頭面部、腋窩、腹部可見暗紫紅色丘疹，糜爛、少量滲液(圖2d)。散發(fā)患者S2：女,32歲；頭皮、腋窩、腹股溝、乳房下叢集分布褐色丘疹、表面覆有油膩性痂皮(圖2e)。散發(fā)患者S3：男，26歲；面頰、頸、軀干部角化性丘疹伴癢(圖2f)。

以上6位患者均經(jīng)組織病理確診(圖2g)：表皮角化過度伴角化不全，棘層松解有腔隙形成，可見絨毛、圓體和谷粒細胞，真皮淺層炎細胞浸潤，診斷為毛囊角化病。并按照Burge等[2]制定的標準分為輕、中、重度。

圖1 家系圖

2a、2b：家系患者I1、II2軀干、上肢、頭面部，角化性丘疹，上覆褐色油膩性痂皮，部分融合成疣狀斑塊，可見破潰,結(jié)痂；2c：家系患者III1頸部散見質(zhì)實小丘疹；2d：散發(fā)患者S1腋部浸漬樣暗紫紅色斑丘疹；2e：散發(fā)患者S2胸腹部散在褐色角化性丘疹；2f：散發(fā)患者S3：軀干部彌漫分布的褐色角化性丘疹，上覆油膩性痂皮；2g:表皮角化過度伴角化不全，棘層松解有腔隙形成，可見絨毛、圓體和谷粒細胞(HE，×200)

圖2患者臨床和組織病理

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 提取 本研究經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會批準，簽署知情同意書后，抽取患者及其家屬外周血5 mL(其中散發(fā)患者家屬外周血未取得)，同時采集100名無親緣關(guān)系的正常個體外周血5 mL作為對照，-80℃保存。采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組DNA，并用全波長紫外/可見光掃描分光光度計ND-8000(Thermo Fisher公司，美國)測定其純度及含量，將其標化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增ATP2A2基因全部外顯子及側(cè)翼序列 根據(jù)既往報道的文獻[6]設計特異性引物18對，交由北京華大基因科技有限公司合成。25 μL PCR反應體系為:PCR taq mix 12.5 μL，dNTP上下游引物各1 μL，DNA模板(30 ng/μL)0.5μL，ddH2O 10 μL。PCR反應條件：預變性94℃ 10 min，變性94℃ 30 s，退火55℃～59℃ 45 s ，延伸72℃ 10 min，共進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 DNA測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)醋酸鈉-乙醇沉淀法純化后直接于ABI 3130XL基因分析儀(Applied Biosystems,美國)上進行測序。

1.2.4 突變分析 所有測序結(jié)果經(jīng)NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等數(shù)據(jù)庫進行分析比對，利用SIFT及Polyphen-2軟件對基因突變進行功能預測。

2 結(jié)果

家系中3例患者均攜帶同一突變，為ATP2A2基因第380位鳥嘌呤突變?yōu)榘奏?c.380 G>A)，導致密碼子出現(xiàn)GGC→GAC的改變，使得第127位氨基酸從甘氨酸(G)變?yōu)樘於彼?D)(p.G127D)(圖3a)，家系中非患者及100名正常對照均未發(fā)現(xiàn)該突變。

散發(fā)病例S1中發(fā)現(xiàn)ATP2A2基因第1676位鳥嘌呤突變?yōu)榘奏?C.1676G>A)，使第559位密碼子由CGA變?yōu)镃AA，導致精氨酸(R)被谷氨酰胺(Q)替代(p.R559Q)(圖3b)；散發(fā)病例S2患者ATP2A2基因第2001位發(fā)現(xiàn)一同義突變c.2001C>T，密碼子GAC被GAT替代，但氨基酸Asp未變化(圖3c)；散發(fā)病例S3未發(fā)現(xiàn)ATP2A2突變。在家系中非患者和100名正常對照中未發(fā)現(xiàn)上述突變(3a～f)。

利用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu)對非同義突變對蛋白質(zhì)的影響進行分析，發(fā)現(xiàn)p.G127D與p.R559Q的預測值分別為0.973和1，預測表明對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響均為“probably damaging”。

利用ExAC、TOPMed數(shù)據(jù)庫對該突變檢索，結(jié)果顯示T的基因頻率分別為0.00002474、2.38910e-05，檢索gnomAD數(shù)據(jù)庫顯示在東亞人群中T的基因頻率為1.08767e-05。此外，我們利用ASSP(http://wangcomputing.com/assp/)對該突變位點所在序列進行選擇性剪接位點預測，結(jié)果顯示該突變位點對剪接位點無影響。

檢索Pubmed和萬方數(shù)據(jù)庫自1999年至今發(fā)表的有關(guān)本病ATP2A2基因突變的文章，發(fā)現(xiàn)已有250多種不同的突變被報道，其中在 2009年報道了一例38歲的突尼斯重癥DD女性患者，其與本研究中散發(fā)患者S1攜帶相同突變基因c.1676G>A[6]；2010年在一斯洛文尼亞家系中發(fā)現(xiàn)同為第559位氨基酸的突變，由于第1675位堿基由胞嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤(c.1675C>G)，而使精氨酸變?yōu)楦拾彼?p.R559G)[7]；2011年意大利人群中在第559位氨基酸上發(fā)現(xiàn)一無義突變c.1675C>T(p.G559*)[8]。

3a：家系的5號外顯子上存在一新發(fā)錯義突變c.380G>A(p.G127D)；3b： S1患者13號外顯子上存在一錯義突變C.1676G>A (p.R559Q)；3c： S2患者14號外顯子上存在一同義突變c. 2001C>T (p.D667D)；3d、3e、3f：正常對照序列

圖3患者突變檢測結(jié)果

3 討論

人類ATP2A2基因長約76 Kb，包含21個外顯子,該基因編碼SERCA2蛋白，SERCA2將鈣離子從胞漿轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)并對表皮的細胞連接和分化起重要作用[9]。1999年Ruiz-Perez等發(fā)現(xiàn)只有該基因編碼的SERCA2b亞型在皮膚中高表達，SERCA2b亞型主要由胞質(zhì)部分的3個結(jié)構(gòu)域:執(zhí)行元件域(A)、磷酸化域(P)、ATP結(jié)合域(N)和11個跨膜蛋白(M1-M11)組成，其中3個結(jié)構(gòu)域在鈣離子結(jié)合和構(gòu)型改變方面起重要作用[10]。SERCA2b亞型具有更高的鈣離子親和力，同時其催化周轉(zhuǎn)率更低，當其發(fā)生突變時會通過降低鈣離子親和力和加快鈣離子周轉(zhuǎn)率來使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生改變，也可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應引起棘層松解、細胞凋亡，最終導致DD的發(fā)生[11]。目前已發(fā)現(xiàn)的突變位點分散于整個基因，很少出現(xiàn)相同突變，且基因型和表型的相關(guān)性也尚未明確[5，10]。

本研究共發(fā)現(xiàn)兩個錯義突變，在該家系的5號外顯子上存在一新發(fā)錯義突變，即c.380G>A，使其編碼的甘氨酸變?yōu)樘於彼?p.G127D)，該突變位于A結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在鈣離子通過SERCA2時起杠桿作用[10]。檢索國內(nèi)外文獻在該氨基酸上尚未發(fā)現(xiàn)其他突變。散發(fā)患者S1的13號外顯子上發(fā)現(xiàn)一錯義突變C.1676G>A，使599位的精氨酸變?yōu)楣劝孵０罚磒.R559Q，該突變位于ATP結(jié)合域，回顧文獻發(fā)現(xiàn)，在突尼斯人群中發(fā)現(xiàn)相同突變，在斯洛文尼亞和意大利人群中發(fā)現(xiàn)同為第559位氨基酸的突變，由此進一步證實了該病不存在種族差異，并推測位于559位的精氨酸為該基因的突變熱點。這兩種突變均可能導致SERCA2蛋白翻譯異常，或表達單倍劑量不足，引起鈣離子儲備耗盡或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子濃度變化，從而影響到表皮細胞分化、細胞間連接等，最終導致DD的發(fā)生[12]。在S2患者14號外顯子上發(fā)現(xiàn)一同義突變c. 2001C>T，利用ExAC、TOPMed、gnomAD數(shù)據(jù)庫對該突變檢索,均顯示該突變極為罕見。此外，我們利用ASSP對該突變位點所在序列進行選擇性剪接位點預測，結(jié)果顯示該突變位點對剪接位點無影響，散發(fā)患者S3中未發(fā)現(xiàn)突變，猜測致病突變位點可能發(fā)生在未測序區(qū)：如啟動子區(qū)域、內(nèi)含子序列或3’非翻譯區(qū)域[4]。環(huán)境、生活習慣等其他因素也可能影響ATP2A2基因的表達，從而影響SERCA2蛋白的功能，另外，該病可能存在其他致病基因。

本家系中三位患者攜帶相同的突變位點，I1、II2患者的病情均十分嚴重，只有III1的癥狀輕微，認為可能與該患兒年齡較小有關(guān)?？偨Y(jié)存在第559位氨基酸突變的患者的臨床表現(xiàn)，其中有3例臨床表現(xiàn)為重度、1例為輕度、1例為中度，提示DD病情的嚴重程度與基因型相關(guān)性的復雜性。

總之，本研究共發(fā)現(xiàn)2種錯義突變，均在國內(nèi)首次報道，豐富了ATP2A2基因的突變數(shù)據(jù)，有助于進一步探討ATP2A2突變和DD之間的關(guān)系，進而有助于今后開展DD的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。DD臨床表型和基因型之間的關(guān)系有待進一步研究。