孫杰，佟子川，郭麗敏，唐學(xué)弘

心房顫動（AF，房顫），是臨床中常見的 心律失常。房顫發(fā)生時，心房收縮和舒張能力異常，導(dǎo)致心臟泵血功能受損，血流瘀滯，易形成血栓栓塞、心力衰竭等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者健康[1,2]。由于我國人口老齡化的加劇，房顫患者人數(shù)不斷上升。目前，房顫的療效并不理想，預(yù)防和治療房顫一直是心血管疾病研究的熱點(diǎn)。microRNAs（miRNAs）是一類高度保守的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡等生物學(xué)過程。多種miRNA通過參與心肌電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。Soeki等[3]研究發(fā)現(xiàn)房產(chǎn)患者血清miR-328水平升高，其與與左心房電壓區(qū)指數(shù)呈正相關(guān)，左心房局部產(chǎn)生miR-328可能參與房顫患者的心房重構(gòu)過程。李菲等[4]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者血清miR-101表達(dá)下調(diào)，其可能通過上調(diào)L型鈣通道β2和鈉鈣交換體（NCX）誘發(fā)或促進(jìn)房顫發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a在心肌中特異性表達(dá)，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞分化、增殖[5]。miR-150表達(dá)與心肌重構(gòu)、心肌纖維化等密切相關(guān)[6]。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測房顫患者血清miR-133a和miR-150表達(dá)水平，分析其臨床意義，為房顫的臨床診斷標(biāo)記物的選擇和該疾病的治療尋找新的突破口。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2015年1月至2016年12月于首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的73例房顫患者為研究對象，其中男性41例，女性32例，年齡39～86歲，平均年齡（59.43±8.71）。依據(jù)2014年《美國心房顫動治療指南》將73例房顫患者分為陣發(fā)性房顫21例、持續(xù)性房顫28例、永久性房顫24例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤患者；②合并自身免疫疾病患者；③合并腎功能不全患者；④臨床資料完整者。另選取25例健康志愿者為對照組，其中男性14例，女性11例，年齡35～85歲，平均年齡（58.27±8.69）歲。所有受試者均自愿簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器RNA提取試劑盒，美國Invitrogen公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，日本Takara公司；引物由金斯瑞生物科技公司設(shè)計(jì)提供。AU5800全自動生化分析儀，貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；Nano-400超微量核酸儀，杭州奧盛儀器有限公司；LightCycler?96實(shí)時熒光定量PCR儀，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 血樣采集采集所有受試者清晨空腹靜脈血，置于抗凝管中，4℃、3500 r/min離心10 min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)心臟彩超檢查獲取受試者左心房內(nèi)徑（LAD）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測運(yùn)用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇 （HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。試劑盒檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）。

1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測血清miR-133a和miR-150水平采用試劑盒提取血清中總RNA，微量核酸儀檢測RNA濃度和純度。在260nm和280nm處吸光值的比值大于1.8時可用于擴(kuò)增。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參U6上游引物5'-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGC-3'，下游引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCT-3'；miR-133a上游引物5'-CAAGCTGGTAAAAATGGA

A-3'；下游引物5'-TATGGTTTTGACGACTGT GTAT-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，總共進(jìn)行45個循環(huán)，72℃延伸10 min。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-133a和miR-150的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較對照組和房顫患者在年齡、性別、吸煙史、飲酒史、TC、TG、HDL-C、收縮壓、舒張壓比較無顯著差異（P＞0.05）。與對照組比，房顫患者LDL-C、hs-CRP、左心房內(nèi)徑和MMP-9水平顯著升高（P＜0.05），LVEF水平顯著降低（P＜0.05）。不同類型房顫患者之間比較，LDL-C、hs-CRP、LAD、LVEF、MMP-9差異也顯著（P＜0.05）（表1～2）。

2.2 對照組和房顫患者血清miR-133a和miR-150比較與對照組比，房顫患者血清miR-133a水平顯著升高（P＜0.05），miR-150水平顯著降低（P＜0.05）（表3）。

表1 對照組和房顫患者一般資料比較

表2 不同類型房顫患者一般資料比較

2.3 不同類型房顫患者血清miR-133a和miR-150比較陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫三組miR-133a水平依次升高，miR-150水平依次降低。三組間miR-133a和miR-150兩兩比較，差異均顯著（P＜0.05）（表4）。

2.4 房顫患者血清miR-133a和miR-150與各檢測指標(biāo)相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，房顫患者血清miR-133a與hs-CRP、左心房內(nèi)徑、MMP-9呈正相關(guān)（P＜0.05），與LVEF呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；miR-150與hs-CRP、左心房內(nèi)徑、MMP-9呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與LVEF呈正相關(guān)（P＜0.05）（表5）。

2.5 miR-133a和miR-150診斷價值miR-133a、miR-150單獨(dú)診斷以及二者聯(lián)合診斷靈敏度分別為78.1%、83.6%、90.4%，特異度分別為68.0%、68.0%、84.0%、，ROC曲線下面積（AUC）分別為0.693、0.705、0.812。與miR-133a、miR-150單獨(dú)診斷相比，二者聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度以及AUC均顯著提高（P＜0.05），結(jié)果如圖1所示。

表3 對照組和房顫患者血清miR-133a和miR-150表達(dá)水平比較

表4 不同類型房顫患者血清miR-133a和miR-150比較

表5 房顫患者血清miR-133a和miR-150與各檢測指標(biāo)相關(guān)性

圖1 miR-133a、miR-150以及二者聯(lián)合診斷的ROC曲線

2.6 logistic回歸分析Logistic回歸分析結(jié)果顯示，與hs-CRP、左心房內(nèi)徑、LVEF和MMP-9類似，miR-133a和miR-150也是影響房顫的因素（P＜0.05），結(jié)果如表6所示。

表6 logistic回歸分析

3 討論

房顫是一種多因素誘導(dǎo)、多機(jī)制參與的心律失常。隨著人口老齡化加劇，房顫的發(fā)病率不斷增加，80歲以上人群患病率超過8%[7]。房顫患者存在心力衰竭、腦卒中等嚴(yán)重的心血管疾病并發(fā)癥，一直以來都是研究的重點(diǎn)。目前，在心律失常尤其是房顫的診斷方面，缺少有效的診斷指標(biāo)來預(yù)測或診斷其發(fā)生情況。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測房顫患者血清miR-133a和miR-150表達(dá)水平并分析其臨床意義，以期為房顫的臨床診斷探尋新的方法或分子標(biāo)記物。

隨著對miRNAs研究的的深入，發(fā)現(xiàn)miRNAs參與心力衰竭、心律失常、冠心病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，可通過調(diào)控不同靶基因在房顫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。miR-133a是肌肉特異性miRNA，在心肌中特異性表達(dá)，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖和分化，可以通過抑制心肌縫隙連接蛋白和離子通道蛋白的表達(dá)參與心律失常的發(fā)生。徐振宇等[9]研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭（CHF）患者血清miR-133a表達(dá)水平顯著升高，其表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)，與左心房內(nèi)徑呈正相關(guān)，檢測CHF患者血清miR-133a變化有助于判斷患者心室重構(gòu)情況。miR-150定位于人19號染色體，主要表達(dá)于心肌組織、淋巴結(jié)和脾臟等組織或器官。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150參與組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展。心肌纖維化能夠造成心機(jī)結(jié)構(gòu)重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致房顫的發(fā)生。周小翠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死邊緣區(qū)miR-150表達(dá)水平顯著下降，上調(diào)其表達(dá)可通過作用靶基因c-Myb改善心肌纖維化。李冰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者射頻消融術(shù)前血漿miR-150水平較健康體檢者顯著降低，術(shù)后miR-150水平較術(shù)前顯著升高，miR-150可能與房顫的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，并能調(diào)控疾病的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與對照組比，房顫患者血清miR-133a水平顯著升高，miR-150水平顯著降低。除此之外，不同類型的房顫患者血清miR-133a和miR-150比較差異也顯著，提示miR-133a和miR-150均參與房顫的發(fā)生、發(fā)展過程，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。 血清作為生物檢測的樣本，具有取材方便、無創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)，因此，血清miRNA可作為診斷房顫或其他疾病發(fā)生的生物標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示，miR-133a、miR-150單獨(dú)診斷房顫發(fā)生具有一定的靈敏度和特異度，二者聯(lián)合診斷時靈敏度和特異度顯著提高，AUC增加，提示miR-133a和miR-150聯(lián)合檢測對于房顫的診斷具有較大的參考價值。

心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫發(fā)生和維持過程中起重要作用。心房間質(zhì)纖維化會導(dǎo)致心肌壁變薄、心房擴(kuò)張、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)等[12]。房顫患者心房明顯纖維化，且隨著纖維化程度越嚴(yán)重，房顫發(fā)生的可能性也越大。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9參與心肌纖維化，影響心肌結(jié)構(gòu)重置[13]。本研究結(jié)果顯示，房顫患者M(jìn)MP-9水平較對照組顯著升高，且不同類型房顫患者M(jìn)MP-9水平比較差異顯著，與相關(guān)研究報(bào)道一致[13,14]。房顫患者血清miR-133a與MMP-9呈正相關(guān)，miR-133a過表達(dá)可能通過抑制胰島素1號生長因子介導(dǎo)MMP-9表達(dá)上調(diào)，參與房顫患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和膠原代謝。超敏C-反應(yīng)蛋白（hsCRP）與心血管疾病關(guān)系密切，hsCRP在房顫炎性標(biāo)志物的臨床應(yīng)用中最為廣泛。李硯杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者h(yuǎn)sCRP較對照組顯著增加，且陣發(fā)性、持續(xù)性、永久性房顫患者之間比較差異顯著，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，房顫患者血清miR-133a與hs-CRP呈正相關(guān)，miR-150與hs-CRP呈負(fù)相關(guān)，提示miR-133a和miR-150也可作為血清標(biāo)志物用于判斷房顫患者嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。房顫過程與心房結(jié)構(gòu)改變相關(guān)，研究證實(shí)，房顫患者心房直徑增加。本研究結(jié)果顯示，房顫患者左心房內(nèi)徑較對照組增加，且不同類型患者之間比較差異顯著，與報(bào)道結(jié)果一致[16]。房顫患者血清miR-133a與左心房內(nèi)徑呈正相關(guān)，miR-150與左心房內(nèi)徑呈負(fù)相關(guān)，提示miR-133a和miR-150可能通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶活性、間質(zhì)纖維化等進(jìn)而增加心房直徑。

綜上所述，房顫患者血清miR-133a和miR-150均表達(dá)異常，參與房顫發(fā)生、發(fā)展。聯(lián)合檢測血清miR-133a和miR-150有望作為房顫患者發(fā)生風(fēng)險的生物學(xué)標(biāo)志物，通過深入研究miR-133a和miR-150在該疾病中的作用機(jī)制，可為房顫治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)。