梁鎮(zhèn)邦，吳仁協(xié)，牛素芳，羅惠桂

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竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及跨物種擴(kuò)增

梁鎮(zhèn)邦，吳仁協(xié)，牛素芳，羅惠桂

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【目的】篩選高多態(tài)性竹?魚（）微衛(wèi)星（SSR）標(biāo)記，并驗(yàn)證其在鲹科魚類中的通用性?！痉椒ā坎捎肧LAF-seq技術(shù)識(shí)別竹?魚基因組SSR標(biāo)記，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳篩選高多態(tài)性位點(diǎn)，并進(jìn)行跨物種PCR擴(kuò)增?！窘Y(jié)果與結(jié)論】識(shí)別出43 264個(gè)二至六堿基重復(fù)SSR標(biāo)記，二、三堿基重復(fù)SSR標(biāo)記較多（90.33%）。篩選出37個(gè)多態(tài)性的二、三堿基SSR位點(diǎn)，各位點(diǎn)的等位基因數(shù)為4 ~ 26，期望雜合度為0.481 ~ 0.935，多態(tài)信息含量為0.440 ~ 0.934。有30個(gè)位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡，且各位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。共有28個(gè)竹?魚SSR標(biāo)記可在1種以上鲹科魚類中有效擴(kuò)增，分別有24、21、20、19和11個(gè)SSR位點(diǎn)可在藍(lán)圓鲹（）、長身圓鲹（）、無斑圓鲹（）、頜圓鲹（）及金帶細(xì)鲹（）中穩(wěn)定擴(kuò)增，可為竹?魚遺傳資源評(píng)估和部分鲹科魚類的系統(tǒng)進(jìn)化分析提供重要遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)及有力的分析手段。

竹?魚；微衛(wèi)星標(biāo)記；跨物種擴(kuò)增；SLAF-Seq技術(shù)

竹?魚（）隸屬鱸形目（Perciformes）鲹科（Carangidae）竹?魚屬(），廣泛分布于西北太平洋，為暖水性中上層重要經(jīng)濟(jì)魚類[1]。21世紀(jì)初，中國竹?魚的年均捕撈量約為3.4萬t，2008年捕撈量達(dá)最高峰，約為5.9萬t[2]。隨著底層、高營養(yǎng)級(jí)魚類資源的衰退，竹?魚的捕撈壓力逐漸增加，已出現(xiàn)小型化、生長加快等生物學(xué)特征退化現(xiàn)象[3-5]。目前，有關(guān)竹?魚的研究主要集中在漁業(yè)資源、攝食習(xí)慣、生物學(xué)特征及食品加工等方面[6-10]，而關(guān)于其分子標(biāo)記和種質(zhì)資源遺傳背景調(diào)查的研究報(bào)道較少。在種質(zhì)資源遺傳學(xué)研究方面，Song等[11]利用線粒體控制區(qū)研究表明，日本沿海、中國福建和北部灣的竹?魚群體可能是單一的隨機(jī)交配群體；Zhao等[12]基于AFLP分析認(rèn)為，竹?魚日本沿海和中國北部灣群體間無明顯的遺傳分化。在微衛(wèi)星標(biāo)記方面，僅Dae等[13]采用富集文庫法開發(fā)出10個(gè)二堿基重復(fù)序列的竹?魚微衛(wèi)星位點(diǎn)。竹?魚種群遺傳資源研究需要大量高多態(tài)性、類型多樣化的微衛(wèi)星標(biāo)記，而已開發(fā)的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。因此，急需開發(fā)更多類型豐富的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)。

微衛(wèi)星DNA亦稱為簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），在真核生物基因組中分布廣泛（每隔10 ~ 50 kb即有1個(gè)SSR），其側(cè)翼序列較為保守，而核心序列存在高度變異[14]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于海洋生物的種質(zhì)資源評(píng)估、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)進(jìn)化等研究[15-18]。目前，有多種SSR標(biāo)記開發(fā)方法。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，高通量測序技術(shù)逐漸取代基因組文庫篩選法、富集文庫法等傳統(tǒng)SSR開發(fā)方法?；诟咄繙y序平臺(tái)的特異性擴(kuò)增片段測序（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq）技術(shù)成本低、周期短、測序深度高，是一種性價(jià)比高、適用范圍廣的SSR開發(fā)方法[19-20]，已成功用于帶魚（）[21]、沙帶魚（）[22]和藍(lán)圓鲹（）[23-24]等多種海洋魚類的SSR標(biāo)記開發(fā)。

本研究采用SLAF-seq技術(shù)識(shí)別竹?魚基因組DNA中的SSR位點(diǎn)，以開發(fā)出多態(tài)性高、類型豐富的SSR標(biāo)記，并檢測其開發(fā)的標(biāo)記在藍(lán)圓鲹、長身圓鲹（）、無斑圓鲹（）、頜圓鲹（）及金帶細(xì)鲹（）等鲹科魚類中的通用性。研究結(jié)果可為竹?魚群體遺傳學(xué)研究和種質(zhì)資源評(píng)估提供多樣化和高分辨力的分子標(biāo)記，也可為相關(guān)鲹科魚類的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供新的分析手段。

1 材料與方法

1.1 樣品與DNA提取

竹?魚（32尾）于2015年4月采自廣東江門上川島，無斑圓鲹（2尾，三亞）、長身圓鲹（8尾，文昌和三亞）、頜圓鲹（1尾，南沙）、藍(lán)圓鲹（6尾，汕頭和廣東雷州珍稀海洋生物國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)）和金帶細(xì)鲹（3尾，廣東雷州珍稀海洋生物國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)）系2014―2016年春季采集于南海北部各漁港。取其背部肌肉，置于體積分?jǐn)?shù)95%酒精中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。參照《分子克隆?shí)驗(yàn)指南》[25]，采用傳統(tǒng)酚-氯仿法提取樣品基因組DNA。

1.2 SLAF-seq測序

將1個(gè)竹?魚肌肉樣品送至北京百邁客生物科技有限公司，采用SLAF-seq技術(shù)進(jìn)行SSR標(biāo)記開發(fā)，參照Sun等[19]和Niu等[24]的方法構(gòu)建基因組文庫、評(píng)估測序質(zhì)量和識(shí)別微衛(wèi)星位點(diǎn)等。從較為豐富的二、三堿基重復(fù)SSR標(biāo)記中隨機(jī)挑選出200個(gè)重復(fù)次數(shù)為7 ~ 20、側(cè)翼序列較長的SSR位點(diǎn)，利用Primer 3.0設(shè)計(jì)各位點(diǎn)引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 SSR引物多態(tài)性

隨機(jī)選取6尾竹?魚的基因組DNA作為模板，對(duì)200對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR體系包括：1.5 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL正反引物（10 μmol/L），1 μL DNA模板（10 ~ 50 ng）和1.5 μLDNA聚合酶。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，62 ~ 52 ℃30 s（每循環(huán)降1 ℃），72 ℃30 s，共25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過聚丙烯凝膠電泳統(tǒng)計(jì)樣品擴(kuò)增成功率和條帶數(shù)，選擇出現(xiàn)3條或以上特異性條帶的位點(diǎn)。

1.4 多態(tài)性引物PCR和分型檢測

參考Schuelke[26]的三引物法進(jìn)行多態(tài)性引物PCR。在多態(tài)性SSR位點(diǎn)的正向引物5′ 端添加M13序列（5′-AGGGTTTTCCCAGTCACG-3′或5′-GAG CGGATAACAATTTCACAC-3′），合成M13標(biāo)記引物，同時(shí)合成相同序列的M13通用引物（用FAM或HEX熒光基團(tuán)修飾其5′ 端）。通過梯度PCR（52 ~ 62℃）摸索M13標(biāo)記引物的最適退火溫度，利用最適退火溫度對(duì)32個(gè)竹?魚樣品進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系：2 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP（10?mmol/L），0.1 μL M13標(biāo)記引物（10 μmol/L），0.6 μL反向引物（10 μmol/L），0.6 μL M13通用引物（10 mmol/L），1 μL DNA模板（10 ~ 50 ng）及1.5 μLDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5?min；95 ℃30 s，（52 ~ 62 ℃）30 s，72 ℃30 s，共26個(gè)循環(huán)；最后72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型檢測。

1.5 跨物種通用性檢測

將篩選出的多態(tài)性竹?魚SSR引物對(duì)頜圓鲹（= 1）、長體圓鲹（= 8）、無斑圓鲹（= 2）、金帶細(xì)鲹（= 4）、藍(lán)圓鲹（= 6）等5種鲹科魚類進(jìn)行通用性檢測。PCR體系和擴(kuò)增程序同1.4，采用聚丙烯凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。膠圖中有1條以上等位基因條帶的位點(diǎn)視為通用位點(diǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過Micro-Checker v.2.2.3[27]檢測等位基因數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，確認(rèn)無誤后，進(jìn)行無效等位基因頻率（ua）評(píng)估及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。利用GenAlEx 6.503軟件[28]計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因數(shù)（a）、有效等位基因數(shù)（e）、表觀雜合度（o）和期望雜合度（e），采用Cervus 3.0.7[29]軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC），使用GenePop 4.3[30]計(jì)算Hardy-weinberg平衡（HWE）、近交系數(shù)（is）以及連鎖不平衡檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果

SLAF測序產(chǎn)生6.11×106原始數(shù)據(jù)（reads），其中GC含量為43.09%，符合測序質(zhì)量要求（堿基質(zhì)量值> 30）的堿基占80.86%。經(jīng)識(shí)別和過濾，共獲得3.16×106個(gè)SLAF標(biāo)簽，測序深度為13.26×。MISA軟件共識(shí)別出43 264個(gè)SSR位點(diǎn)，其中二堿基重復(fù)SSR（Di-nucleotide）29 457個(gè)（68.09%），三堿基重復(fù)SSR（Tri-nucleotide）9 623個(gè)（22.24%），四堿基重復(fù)SSR（Tetra-nucleotide）2 939個(gè)（6.79%），五堿基重復(fù)SSR（Penta-nucleotide）956個(gè)（2.21%），六堿基重復(fù)SSR（Hexa-nucleotide）289個(gè)（0.67%）。

2.2 多態(tài)性SSR位點(diǎn)篩選

基于6個(gè)竹?魚基因組DNA，從200個(gè)二、三堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)中初步篩選多態(tài)性位點(diǎn)。結(jié)果顯示，26個(gè)位點(diǎn)無擴(kuò)增條帶，71個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出1條特異性條帶，53個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出2條特異性條帶，分別有20、22、4、4個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出3、4、5、6條特異性條帶。

最后挑選出50個(gè)可擴(kuò)增出3條或以上特異性條帶的SSR標(biāo)記合成M13標(biāo)記引物，并在32尾竹?魚中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終36個(gè)多態(tài)性SSR位點(diǎn)能在27 ~ 32個(gè)竹?魚樣品中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出特異性條帶，1個(gè)位點(diǎn)（TJ2-20）僅在19個(gè)樣品中擴(kuò)增出特異性條帶。37個(gè)SSR位點(diǎn)的GenBank登錄號(hào)為MK357853―MK357889（表1、2）。

2.3 竹?魚SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

各位點(diǎn)的遺傳多樣性數(shù)據(jù)如表2所示。37個(gè)SSR位點(diǎn)在32個(gè)竹?魚樣品中共檢測到508個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為13.73，其中TJ2-39位點(diǎn)的等位基因數(shù)最少（a= 4），TJ2-24位點(diǎn)的等位基因數(shù)最多（a= 26）；有效等位基因數(shù)為2.002 ~ 15.929，平均6.90。16個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)之間的差值小于6，說明這些SSR位點(diǎn)的等位基因在被測群體基因組中的分布比較均勻。期望雜合度為0.481 ~ 0.935，平均值為0.807；觀測雜合度為0.508 ~ 0.955，平均值為0.739。多態(tài)信息含量為0.440 ~ 0.934，平均值為0.771。經(jīng)Bonferroni校正后，TJ2-10、TJ2-11、TJ2-17、TJ2-23、TJ2-36和TJ2-44位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡（< 0.001 4），這6個(gè)位點(diǎn)均具有較高的無效等位基因頻率（ua= 0.049 8 ~ 0.189 2）和近交系數(shù)（is= 0.131 0 ~ 0.433 4），其他31個(gè)位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

表1 37個(gè)竹?魚SSR標(biāo)記信息

表2 37個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)特征

注：a：退火溫度；：樣品數(shù)；*：經(jīng)Bonferroni校正后顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(= 0.05,< 0.001 4)

2.4 跨物種擴(kuò)增

37個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)的跨物種擴(kuò)增結(jié)果如表3所示。有28個(gè)SSR位點(diǎn)可在1種以上鲹科魚類中進(jìn)行有效擴(kuò)增（占已開發(fā)位點(diǎn)的75.68%），其中6個(gè)位點(diǎn)可在5種鲹科魚類中擴(kuò)增，7個(gè)位點(diǎn)可在4種鲹科魚類中擴(kuò)增，5個(gè)位點(diǎn)可在3種鲹科魚類中擴(kuò)增，5個(gè)位點(diǎn)可在2種鲹科魚類中擴(kuò)增，5個(gè)位點(diǎn)可在1種鲹科魚類中擴(kuò)增。其中，竹?魚SSR位點(diǎn)在藍(lán)圓鲹和長身圓鲹中的通用性較佳，擴(kuò)增成功率分別為64.86%和56.76%；在無斑圓鲹和頜圓鲹中的通用性次之，擴(kuò)增成功率分別為54.05%和51.35%；而在金帶細(xì)鲹中的通用性較差，擴(kuò)增成功率為29.73%。可見，竹?魚SSR位點(diǎn)的側(cè)翼序列在部分鲹科魚類中有一定保守性。

表3 37個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)在5種鲹科魚類中的跨物種擴(kuò)增

注:，樣品數(shù)；+，可擴(kuò)增；-，不可擴(kuò)增；AL，可擴(kuò)增率（%）；括號(hào)里為等位基因數(shù)

3 討論

3.1 SLAF-seq技術(shù)開發(fā)SSR標(biāo)記

本研究獲得的竹?魚基因組測序質(zhì)量30為80.86%，GC含量為43.09%，表明用SLAF-seq技術(shù)獲得的基因組數(shù)據(jù)質(zhì)量較佳，可用于后續(xù)SSR位點(diǎn)開發(fā)。在竹?魚基因組中共獲得39 080個(gè)（90.33%）常見的短堿基重復(fù)SSR（二堿基和三堿基），亦檢測出4 184個(gè)（9.67%）相對(duì)稀少的長堿基重復(fù)SSR（四至六堿基）。而傳統(tǒng)的SSR開發(fā)方法獲得的SSR類型基本是二堿基或復(fù)合二堿基，且數(shù)量較少。如Dae等[13]通過磁珠富集文庫法僅獲得10個(gè)竹?魚二堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)，Cristian等[31]利用磁珠富集文庫法開發(fā)出8個(gè)智利竹?魚（）SSR位點(diǎn)（二堿基4個(gè)、復(fù)合二堿基1個(gè)、三堿基2個(gè)、4堿基1個(gè)）?？梢?，本研究利用SLAF技術(shù)開發(fā)出的SSR數(shù)量和類型遠(yuǎn)超傳統(tǒng)的SSR開發(fā)方法，表明基于高通量測序的SLAF技術(shù)是較為快速、高效的SSR分離方法。

在本研究隨機(jī)挑選的200個(gè)SSR位點(diǎn)中，有174個(gè)（87%）位點(diǎn)可擴(kuò)增出1條以上特異性條帶；在可擴(kuò)增出3條或以上特異性條帶的50個(gè)位點(diǎn)中，有36個(gè)（72%）多態(tài)性位點(diǎn)可在27 ~ 32個(gè)竹?魚樣品中穩(wěn)定擴(kuò)增出特異性條帶，表明竹?魚SSR開發(fā)成功率較高，提示本研究所獲得的43 264個(gè)SSR位點(diǎn)標(biāo)記開發(fā)潛力可能較高，可為后續(xù)篩選出高多態(tài)性的SSR標(biāo)記提供充足的遺傳物質(zhì)來源基礎(chǔ)。

3.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性及其遺傳學(xué)特征

遺傳多樣性分析可反映群體內(nèi)遺傳變異情況，可作為篩選優(yōu)良SSR位點(diǎn)判斷依據(jù)。Barker[32]和Botstein等[33]認(rèn)為，若SSR標(biāo)記多于26個(gè)，每個(gè)標(biāo)記至少有4個(gè)等位基因數(shù)，且每個(gè)標(biāo)記多態(tài)性信息含量較高（PIC > 0.5），可認(rèn)為遺傳多樣性分析結(jié)果較為可信且研究群體遺傳多樣性較豐富。本研究中，各位點(diǎn)平均等位基因數(shù)為13.73，平均多態(tài)信息含量為0.772，表明廣東江門群體遺傳變異水平較高。

本研究中，竹?魚SSR位點(diǎn)平均等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量高于Cristian等[31]開發(fā)的8個(gè)智利竹?魚二堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)(a=10.88，o=0.709，e=0.786)和張浩冉等[22]開發(fā)的28個(gè)沙帶魚二、三堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)(a= 9.11，o= 0.634，PIC= 0.670)，但與Dae等[13]開發(fā)的10個(gè)竹?魚二堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)(a=14，o=0.695，e=0.805)、Galleguillos等[34]開發(fā)的9個(gè)智利竹?魚四堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)（a= 13.75，o= 0.808，e= 0.875）和翟云等[23]開發(fā)的31個(gè)藍(lán)圓鲹四、五堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)(a= 13.48，o= 0.650，PIC= 0.803)相當(dāng)，表明本研究所開發(fā)竹?魚SSR標(biāo)記多態(tài)性和分辨力均較高。

經(jīng)Bonferroni校正后，共有6個(gè)SSR位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡，可能與有無效等位基因、近親交配、自然選擇及種群退化等相關(guān)[35-36]。6個(gè)位點(diǎn)近交系數(shù)（0.131 ~ 0.433）和無效等位基因頻率（0.050 ~ 0.189）均較高，故可認(rèn)為二因素是造成6個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡的重要原因。其次，竹?魚的捕撈壓力日益增大，海洋環(huán)境逐漸惡化，可能導(dǎo)致自然選擇壓力逐漸增大，進(jìn)而引發(fā)竹?魚呈繁殖率上升、壽命縮短、體型變小等種群退化現(xiàn)象[4,37]。因此，自然選擇和種群退化也可能是這6個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡的因素。此外，楊君等[38]基于SSR標(biāo)記分析刺槐葉癭蚊（）遺傳多樣性指數(shù)與樣本量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，樣本量小于25時(shí)，對(duì)平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)及觀測雜合度均有較明顯影響。本研究中，TJ2-20位點(diǎn)的有效擴(kuò)增個(gè)體數(shù)為19，可認(rèn)為該位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)存在一定偏差。發(fā)生變異的SSR位點(diǎn)側(cè)翼序列和有缺陷引物可降低引物與位點(diǎn)側(cè)翼序列的匹配度，可能是TJ2-20位點(diǎn)的有效擴(kuò)增個(gè)體數(shù)偏少的重要原因。

綜上，本研究開發(fā)的37個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)有較高的分辨力和多態(tài)性水平，其中30個(gè)位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡，可為竹?魚種質(zhì)資源評(píng)估和遺傳學(xué)研究提供有力工具和技術(shù)支撐，而偏離哈迪-溫伯格平衡的6個(gè)SSR位點(diǎn)和有效擴(kuò)增個(gè)體數(shù)少于25的SSR位點(diǎn)需謹(jǐn)慎使用。

3.3 SSR標(biāo)記的跨物種擴(kuò)增

Primmer等[39]提出，SSR標(biāo)記的跨物種擴(kuò)增成功率與物種間的遺傳分化程度呈負(fù)相關(guān)?；诰€粒體COI和Cyt的遺傳距離顯示，竹?魚與藍(lán)圓鲹、長身圓鲹、無斑圓鲹、頜圓鲹、金帶細(xì)鲹的遺傳距離分別為0.1081、0.1274、0.1282、0.1336、0.1695[24]。而37個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)在這五種鲹科魚類中的跨物種擴(kuò)增成功率依次為藍(lán)圓鲹64.86%、長身圓鲹56.76%、無斑圓鲹54.05%、頜圓鲹51.35%、金帶細(xì)鲹29.73%?？梢?，竹?魚SSR位點(diǎn)在幾種鲹科魚類中的跨物種擴(kuò)增成功率與種間遺傳距離明顯呈反比，結(jié)果進(jìn)一步支持了Primmer等[39]的結(jié)論。

跨物種擴(kuò)增可為近緣物種提供SSR位點(diǎn)信息，降低SSR開發(fā)成本、減少工作量，且更易于獲得高多態(tài)性的SSR標(biāo)記，是SSR標(biāo)記獲取途徑中較經(jīng)濟(jì)方便的方法之一。本研究中，分別有24、21、20、19、11個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)可在藍(lán)圓鲹、長身圓鲹、無斑圓鲹、頜圓鲹及金帶細(xì)鲹中穩(wěn)定擴(kuò)增，這些位點(diǎn)可為5種鲹科魚類的群體遺傳學(xué)等相關(guān)研究提供直接的標(biāo)記來源。18個(gè)位點(diǎn)可在3 ~ 5種鲹科魚類中穩(wěn)定擴(kuò)增，說明這些位點(diǎn)在部分鲹科魚類中保守性較高，可為部分鲹科魚類系統(tǒng)進(jìn)化研究提供有力的技術(shù)支持。

4 結(jié)論

基于SLAF-seq技術(shù)，共檢測到43 264個(gè)二至六堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)，所得SSR開發(fā)成功率較高，可為篩選高質(zhì)量SSR標(biāo)記及種質(zhì)資源研究提供重要遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。從200個(gè)二、三堿基重復(fù)SSR標(biāo)記中成功開發(fā)出37個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)，其中30個(gè)SSR位點(diǎn)遺傳信息含量較高，可為竹?魚種質(zhì)資源評(píng)估提供有力的分析手段。28個(gè)竹?魚SSR位點(diǎn)在藍(lán)圓鲹、長身圓鲹等魚類中有通用性，可為5種鲹科魚類的群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化研究等提供新的分子標(biāo)記。

[1] 劉靜, 吳仁協(xié), 康斌, 等. 北部灣魚類圖鑒[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2016: 155.

[2] 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局. 1999-2017年中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999-2017.

[3] 丁琪, 陳新軍, 李綱, 等. 基于漁獲統(tǒng)計(jì)的西北太平洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用評(píng)價(jià)[J]. 資源科學(xué), 2013, 35(10): 2032-2040.

[4] 張魁, 廖寶超, 許友偉, 等. 基于漁業(yè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的南海區(qū)漁業(yè)資源可捕量評(píng)估[J]. 海洋學(xué)報(bào), 2017, 39(8): 25-33.

[5] 張靜, 姚壯, 林龍山, 等. 北部灣口和南沙群島西南部海域主要漁獲種類的生物學(xué)特征及其數(shù)量分布[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 46(11): 158-167.

[6] 王雪輝, 邱永松, 杜飛雁, 等. 北部灣秋季底層魚類多樣性和優(yōu)勢種數(shù)量的變動(dòng)趨勢[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 32(2): 333-342.

[7] 蔣日進(jìn). 東海竹?魚的攝食習(xí)性：2012年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C/OL]. 中國鄭州, 中國水產(chǎn)學(xué)會(huì), 2012: 227.[2018-11-20]. http://kns.cnki.net/KCMS/detail/ detail.aspx?dbcode=CPFD&dbname=CPFD0914&filename=OGSB201211001217..

[8] 李忠爐, 張文旋, 何雄波, 等. 南海北部灣秋季藍(lán)圓鲹與竹?魚的攝食生態(tài)及食物競爭[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(3): 79-86.

[9] 胡曉亮, 陳慶余, 沈建. 東海南部竹?魚形態(tài)特征參數(shù)及其相關(guān)性比較分析[J]. 動(dòng)物分類學(xué)報(bào), 2013, 38(2): 407-412.

[10] 王雨生, 陳海華. 凝膠化時(shí)間和卵清蛋白添加量對(duì)竹?魚魚糜凝膠特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(3): 64-69.

[11] SONG N, JIA N, YANAGIMOTO T, et al. Genetic differentiation offrom the Northwestern Pacific based on the mitochondrial DNA control region [J]. Mitochondrial DNA, 2013, 24(6): 705-712.

[12] ZHAO L L, SONG N, LI N, et al. Genetic diversity and population structure of a pelagic fish, Jack Mackerel (), based on AFLP analysis [J]. Pakistan Journal of Zoology, 2015, 47(3): 711-717.

[13] DAE S C, HYE S A, TAEG Y O, et al. Eleven new microsatellite markers in Jack Mackerel () derived from an enriched genomic library [J]. Genes and Genomics, 2009, 31(6): 397-402.

[14] 郭寶英, 謝從新, 熊冬梅. 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)及其在魚類中的應(yīng)用[J]. 水利漁業(yè), 2007(4): 5-9.

[15] 徐秀菊, 劉麗, 劉楚吾, 等. 流沙灣卵鰨微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 34(4): 14-18.

[16] 常城, 韓慧宗, 王騰騰, 等. 基于RAD測序技術(shù)的單環(huán)刺螠（）微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及5個(gè)地理群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 海洋與湖沼, 2017, 48(3): 498-507.

[17] 邱昌亮. 黃姑魚高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及其應(yīng)用[D]. 廈門：集美大學(xué), 2018.

[18] 張佳佳, 李杰, 張國松, 等. 雜交黃顙魚(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂)及其雙親遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2018, 37(5): 612-621.

[19] SUN X W, LIU D Y, ZHANG X F, et al. SLAF-seq: an efficient method of large-scale de novo SNP discovery and genotyping using high-throughput sequencing [J]. PloS one, 2013, 8(3): e58700.

[20] 梅楚剛, 王洪程, 昝林森, 等. 基于高通量測序的動(dòng)物基因組研究進(jìn)展[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 44(3): 43-51.

[21] 張浩冉, 梁鎮(zhèn)邦, 吳仁協(xié), 等. 利用SLAF-seq技術(shù)開發(fā)帶魚()微衛(wèi)星標(biāo)記以及跨物種擴(kuò)增檢測[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2019, 38(2): 574-585.

[22] 張浩冉, 梁鎮(zhèn)邦, 吳仁協(xié), 等. 基于SLAF-seq技術(shù)的沙帶魚()微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)以及在近緣種中的通用性[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2018, 37(8): 3331-3338.

[23] 翟云, 吳仁協(xié), 牛素芳, 等. 基于SLAF-seq技術(shù)開發(fā)藍(lán)圓鲹微衛(wèi)星標(biāo)記及跨物種擴(kuò)增檢測[J]. 應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 37(3): 426-434.

[24] NIU S F, ZHAI Y, WU R X, et al. Isolation and characterization of 49 polymorphic microsatellite loci forusing SLAF-seq, and cross-amplification to related species [J]. Journal of Oceanology and Limnology, 2019, 1(1): 245-255.

[25] 薩姆布魯克 J, 拉塞爾 D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 3版. 黃培堂, 王嘉璽, 朱厚礎(chǔ), 等譯. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 463-471.

[26] SCHUELKE M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments[J]. Nature Biotechnology, 2000, 18(2): 233-234.

[27] VAN OOSTERHOUT C, HUTCHINSON W F, WILLS D P M, et al. MICRO-CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data [J]. Molecular Ecology Notes, 2004, 4(3): 535-538.

[28] PEAKALL R, SMOUSE P E. GenAlEx 6.5-genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research – an update [J]. Bioinformatics, 2006, 28(19): 2537-2539.

[29] KALINOWSKI S T, TAPER M L, MARSHALL T C. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment [J]. Molecular Ecology, 2007, 16(5): 1099-1106.

[30] ROUSSET F. Genepop’007: a complete re-implementa- tion of the genepop software for Windows and Linux [J]. Molecular Ecology Resources, 2008, 8(1): 103-106.

[31] CRISTIAN B, CANALES A, SANDRA F. Isolation and characterization of microsatellite loci for the jack mackerel (Nichols, 1920) [J]. Conservation Genetics, 2009, 11(3): 1235-1237.

[32] BARKER J S F. A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds [C]. Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, 1994, 21: 501-508.

[33] BOTSTEIN D, WHITE R L, SKOLNICK M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms [J]. American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3): 314-331.

[34] GALLEGUILLOS R, CANALES-AGUIRRE C B, FERRADA S. Genetic variability in jack mackerelNichols: New SSRs loci and application [J]. Gayana, 2012, 76(1): 67-71.

[35] PEMBERTON J M, SLATE J, BANCROFT D R, et al. Nonamplifying alleles at microsatellite loci: a caution for parentage and population studies [J]. Molecular Ecology, 1995, 4(2): 249-252.

[36] YU H T, LEE Y J, HUANG S W, et al. Genetic analysis of the populations of Japanese anchovy (Engraulidae:) using microsatellite DNA [J]. Marine Biotechnology, 2002, 4(5): 471-479.

[37] 晏然, 范江濤, 徐姍楠, 等. 南海北部近海竹?魚棲息地分布特征[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2018, 37(8): 2430-2435.

[38] 楊君, 尚興樸, 姚艷霞, 等. 基于微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析刺槐葉癭蚊遺傳多樣性指數(shù)與樣本量的相關(guān)性[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2018, 31(5): 118-124.

[39] PRIMMER C R, PAINTER J N, KOSKINNEN M T, et al. Factors affecting avian cross-species microsatellite amplification [J]. Journal of Avian Biology, 2005, 36(4): 348-360.

Microsatellite Loci Development inby SLAF-seq Technology and Cross-amplification in Five Carangidae Fishes

LIANG Zhen-bang, WU Ren-xie, NIU Su-fang, LUO Hui-gui

（,,524088,）

【Objective】 To develop polymorphic microsatellite markers forand assess their transferability in five Carangidae fishes.【Methods】 The specific-locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq) technology was employed to mine the genomic information and isolate microsatellite loci in. Microsatellite polymorphism and cross-amplification were explored by capillary electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis, respectively.【Result and Conclusion】 SLAF-seq identified 43 264 di- to hexa-nucleotide repeat microsatellites, of which di-nucleotide and tri-nucleotide repeat loci were the most frequent (90.33%).Furthermore, 37 primer pairs of di- and tri-nucleotide repeat loci were successfully designed and exhibited polymorphism. The number of alleles per locus ranged from 4 to 26. The expected heterozygosity and polymorphism information content ranged from 0.481 to 0.935 and from 0.440 to 0.934, respectively.Thirty microsatellite markers were consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium and showed no linkage disequilibrium. A total of 28 SSR markers forcould successfully cross-amplify in at least one species of Carangidae.A total of 24, 21, 20, 19, and 11 out of 37 microsatellite loci could cross-amplify in,,,and, respectively. These microsatellite markers could provide a powerful molecular tool for the genetic resource assessment ofand phylogeny study of the related Carangidae species.

; microsatellite loci; cross-species amplification; SLAF-seq

Q78；Q959.483.3

A

1673-9159（2019）04-0005-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.002

2019-03-03

廣東省自然科學(xué)基金-博士啟動(dòng)資助項(xiàng)目（2016A030310329）；廣東海洋大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（HDYQ2017002）；廣東海洋大學(xué)科研啟動(dòng)費(fèi)資助項(xiàng)目（R17040）；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2017A030303077）；廣東省海洋和漁業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（科技攻關(guān)與研發(fā), A201708D07）

梁鎮(zhèn)邦（1994—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)轸~類生物多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化。E-mail: liangzhenbang0403@163.com

牛素芳（1987—），女，講師，博士，研究方向?yàn)轸~類種群遺傳學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)。E-mail: wolf0487@126.com

梁鎮(zhèn)邦，吳仁協(xié)，牛素芳，等. 竹?魚微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及跨物種擴(kuò)增[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（4）：5-12.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）