張雨婷，曾嫚玉，馬佳儀，李嘉欣，焦 鈺,，杜曉東

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馬氏珠母貝腎上腺素能受體（）分子特征和表達(dá)分析

張雨婷1，曾嫚玉1，馬佳儀1，李嘉欣1，焦 鈺1,2，杜曉東2

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 / 2. 廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088）

【目的】研究馬氏珠母貝（）腎上腺素能受體（）的生物學(xué)功能?！痉椒ā坷胏DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）克隆獲得基因的cDNA的全長序列并對其序列特征進(jìn)行分析，實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（qRT-PCR）檢測馬氏珠母貝不同組織中基因mRNA的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果與結(jié)論】的cDNA全長2 426 bp，包括開放閱讀框（ORF）2 091 bp，編碼696個(gè)氨基酸，5′UTR長144 bp，3′UTR長191 bp，預(yù)測分子質(zhì)量79.0 ku，理論等電點(diǎn)9.18，多重序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同物種間的保守性較高。軟件分析結(jié)果顯示的氨基酸序列具有7個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果表明，基因在各組織中均有表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高，在肝胰腺和性腺中表達(dá)量也較高。

馬氏珠母貝；腎上腺素能受體；分子特征；表達(dá)分析

腎上腺素能受體（beta 2 adrenergic receptor，）屬于G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCR）家族，在體內(nèi)可被腎上腺素激活[1]。參與調(diào)控免疫細(xì)胞[2-3]，以及膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等的調(diào)控[4-6]。腎上腺素能受體有3個(gè)亞型，分別是、、，在同種動物體內(nèi)這3種受體的氨基酸同源性接近50%，同一種受體的同源性在不同種類動物之間可達(dá)75%及以上[7]。含有7個(gè)跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域，有3個(gè)細(xì)胞外環(huán)，其中一個(gè)是氨基末端，3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)，有羧基末端[8]。

調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)是通過G蛋白依賴的G蛋白偶聯(lián)受體激酶2信號通路（G-protein-coupled receptor kinases，GRK2）和抑制蛋白2（β-arrestin2）信號通路。被相應(yīng)的配體激活后被GRK2磷酸化，后β-arrestin 2移動至細(xì)胞膜并結(jié)合磷酸化的受體，使該受體與G蛋白結(jié)合，可促進(jìn)內(nèi)化和脫敏[4]。在炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮免疫抗炎功能，通過抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）生成、阻止白細(xì)胞黏附和減少毛細(xì)血管通透性等[9]。研究表明，在神經(jīng)系統(tǒng)對免疫的調(diào)控中，交感神經(jīng)可以通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)，激活細(xì)胞表面的腎上腺素能受體，通過介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮細(xì)胞免疫功能[2]。去甲腎上腺素刺激后單核或者巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎因子增加、促炎因子減少[10]。關(guān)于的功能報(bào)道，在軟體動物中僅見于縊蟶[11]，在馬氏珠母貝中尚未見相關(guān)報(bào)道。

馬氏珠母貝（），屬于軟體動物門雙殼綱，又稱合浦珠母貝（），是海水珍珠養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)物種，其生長環(huán)境的特殊性，使其易于被病原體和微生物侵染[12]。目前對貝類病害的相關(guān)研究尚不成熟，致使我國貝類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展緩慢，因此貝類免疫相關(guān)基因研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）克隆獲得基因的cDNA的全長序列并對其序列特征進(jìn)行分析；實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（qRT-PCR）檢測馬氏珠母貝不同組織中基因mRNA的表達(dá)水平，分析馬氏珠母貝關(guān)于免疫和應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)基因，了解其免疫機(jī)制，以期為提高馬氏珠母貝抗病能力和降低插核后的免疫排斥提供理論支持，為進(jìn)一步探究在貝類免疫機(jī)制中的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用貝為大小一致、生長狀況良好的2齡馬氏珠母貝，用于qRT-PCR的材料取自貝體的外套膜套膜區(qū)（MP）和中央膜（MC）、閉殼肌（A）、鰓（GI）、血細(xì)胞（B）、性腺（GO）、足（F）和肝胰腺（HE），RACE擴(kuò)增所用材料為馬氏珠母貝的性腺和鰓。樣品取出后立即放于液氮中速凍，超低溫冰箱-80 ℃保存。感受態(tài)細(xì)胞DH5α保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol Lipofectamine?2000 CD購買于Invitrogen公司，Reverse Transcriptase M-MLV、SMARTer RACE 5′/3′Kit、rTaq酶、PMD-18T Vector購買于TaKaRa公司，GeneJET PCR Purification Kit購買于Thermo Scientific公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出注釋基因高度相似的unigene序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA第一鏈的合成 分離馬氏珠母貝的各組織，在2.5 mL離心管中加入1 mL Trizol后，再加入約100 mg組織量，經(jīng)組織研磨儀研磨后參照Trizol試劑說明書抽提馬氏珠母貝各組織的總RNA。分別取各組織2 μL用于瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀[（260 nm）/（280 nm）比值]檢測其完整性、濃度及純度。根據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV SMARTer RACE 5′/3′ Kit說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈[13]。

1.2.2基因的克隆 使用巢式PCR依次進(jìn)行中間片段、5′端、3′端的擴(kuò)增。將產(chǎn)物純化回收后連接至pMD18-T載體，再轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)后，挑取單一陽性克隆樣品送至上海生工進(jìn)行測序[14]。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.3 序列分析 利用DNAMAN軟件將中間片段與5′端、3′端片段進(jìn)行拼接，獲得了全長cDNA。利用在線工具ORF Finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）對基因進(jìn)行開放閱讀框（ORF）和氨基酸序列的預(yù)測；利用ExPASY（http://web.expasy.org/ protparam/）分析其理化性質(zhì)；利用SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal/）預(yù)測其是否有信號肽；經(jīng)Motif（http://myhits.isb-sib.ch/cgi -bin/motif_scan）對其進(jìn)行功能位點(diǎn)的預(yù)測；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；用SWISS-MODEL（http:// swissmodel.expasy.org/）預(yù)測的3級結(jié)構(gòu)；采用MEGA7的 Neighbor-Joining 法構(gòu)建進(jìn)化樹，檢驗(yàn) Bootstrap 值并設(shè)置抽樣次數(shù)為 500 次；利用DNAMAN軟件對馬氏珠母貝與已知的不同動物氨基酸多序列進(jìn)行比對[15]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測組織差異表達(dá) 以為內(nèi)參基因，各組織的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，反應(yīng)體系（10 μL）：10 μmol/L的上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 0.5 μL，SYBR?Select Master Mix 5 μL，滅菌的ddH2O 3.7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性 2 min，95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火 1 min，40個(gè)循環(huán)，添加1個(gè)溶解曲線。每個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù) 3 次進(jìn)行。采用2-ΔΔCT分析法，樣本重復(fù)性和組織間差異性利用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pmβ2AR基因cDNA全長的克隆及序列分析

克隆得馬氏珠母貝（）894 bp 的5′ 端上游序列和415 bp 的3′ 端下游序列，拼接后得到2 426 bp的全長cDNA。其中5′UTR為144 bp，3′UTR為191 bp，包含3′末端25 bp的poly A尾巴。開放閱讀框長2 091 bp，編碼696個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 Pmβ2AR氨基酸序列理化性質(zhì)

預(yù)測分子質(zhì)量約為69.0 ku，理論等電點(diǎn)為9.18。氨基酸序列中帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp和Glu）共63個(gè)，正電荷數(shù)的氨基酸殘基（Arg和Lys）共80個(gè)。預(yù)測此氨基酸不穩(wěn)定指數(shù)（II）為46.35，將此蛋白質(zhì)分類為不穩(wěn)定蛋白；親水指數(shù)為-0.398，為親水蛋白（圖2），N-端不存在信號肽；具有跨膜區(qū)域，表明該蛋白不是胞質(zhì)蛋白。經(jīng)預(yù)測，氨基酸序列在73~342位含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在371~440位含有兩個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域，對蝦夷扇貝進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析得知其具有相同的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3）。氨基酸序列中其他功能位點(diǎn)包括cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)5個(gè)，n-糖基化位點(diǎn)10個(gè)，酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)1個(gè)等。經(jīng)SOPMA 軟件預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，α螺旋為33.19%，延伸鏈（Ee）為17.96 %，β轉(zhuǎn)角（Tt）為4.17%，無規(guī)則卷曲（Cc）為44.68 %。用SWISS-MODEL軟件預(yù)測蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)，與蝦夷扇貝有較高相似性（圖4）。

2.3 Pmβ2AR的多序列比對和同源性分析

采用DNAMAN軟件將與珍珠雞（, XP_021266164.1)、墨西哥麗脂鯉（，XP_007232946.2）、熱帶爪蟾（，NP_001116897.2）和蝦夷扇貝（，OWF49060.1）的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果顯示，與蝦夷扇貝的相似性最高為70%（圖5）。將的氨基酸序列用NCBI與其他物種進(jìn)行對比，得到小鼠（，NP_031446.2）、馬氏珠母貝、蝦夷扇貝、地中海果蠅（，XP_023159092.1）、智人（，NP_000015.1）、斑馬魚（，NP_001082940.2）、亞洲水牛（，XP_006052758.1）、綠頭鴨（，XP_005010059.3）、美洲牡蠣（，XP_022294171.1）、美洲鱟（，XP_013791385.1）、紅鰭東方鲀（，XP_011609112.1）、多疣壁虎（，XP_015262106.1）、青鳉（，XP_015232667.1）、熱帶爪蟾和長牡蠣（，XP_011439690.1）的氨基酸序列，以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，脊椎動物聚為一個(gè)分支；馬氏珠母貝與蝦夷扇貝聚為一簇，與蝦夷扇貝的親緣關(guān)系最近，結(jié)果與傳統(tǒng)的分類相吻合（圖6）。

5′ 和 3′ 非編碼區(qū)用小寫字母表示; 始密碼子ATG和終止密碼子TAG用方框標(biāo)注; 雙劃線部分為7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；陰影部分為2個(gè)低復(fù)雜區(qū)；虛線部分為cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；單劃線部分為n-糖基化位點(diǎn)；波浪線部分為酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)

5′ UTR and 3′ UTR are indicated with small letters; Nucleotide with a frame represents the initiation codon (ATG) and stop codon (TGA); The double underline sequence represents 7 Transmembrane region; The shaded part represents 2 low complexity; The dashed underlined sequence represents cAMP and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites; The single underlined sequence represents n-glycosylation sites; The wavy underlined sequence represents indicates tyrosine kinase phosphorylation sites

圖1基因的核酸序列分析

Fig. 1 The nucleotide sequence analysis of

“+”: 疏水性 Indicates hydrophobicity; “-”: 親水性 Indicates hydrophilicity

圖3 Pmβ2AR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域

圖4 蝦夷扇貝（A）、馬氏珠母貝（B）β2AR蛋白分子結(jié)構(gòu)

“*”與灰色背景均表示保守的氨基酸

“*”and the gray background indicated the conserved amino acid

圖5結(jié)構(gòu)域區(qū)的氨基酸序列多序列比對

Fig. 5 Multi-sequence alignment of amino acid sequence of Pdomains

圖6 基于NJ法構(gòu)建的β2AR系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 Pmβ2AR的組織表達(dá)分析

在馬氏珠母貝的血細(xì)胞、鰓、閉殼肌、性腺、肝、中央膜區(qū)、足和套膜區(qū)中均有表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高（< 0.05）；其次是肝胰腺和性腺，在閉殼肌中表達(dá)量最低。

MP: 套膜區(qū); A: 閉殼肌; MC: 中央膜區(qū); HE: 肝胰腺; GI: 鰓; F: 足; B:血細(xì)胞; GO: 性腺; 凡有一個(gè)標(biāo)記相同字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）

MP: Pallial zone; A: Adductor muscle; MC: Central zone; He: Hepatopancreas; GI: Gill; F: Foot; B: Blood cells; GO: Gonads; Same letters indicated no significant difference（＞0.05）

圖7在馬氏珠母貝不同組織中的表達(dá)分布

Fig. 7 Expression distribution ofin different tissues from

3 討論

目前的研究主要集中在脊椎動物中，無脊椎動物中特別是海洋軟體動物的研究極少。本實(shí)驗(yàn)通過軟件分析顯示氨基酸序列與其他物種的具有相似的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。經(jīng)軟件預(yù)測沒有信號肽，氨基酸序列分析認(rèn)定為親水蛋白。是受體蛋白，分布在3個(gè)細(xì)胞相中，而N端位于細(xì)胞外表面并延伸到疏水區(qū)域，其與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的親水環(huán)相接觸，與前人關(guān)于的研究相符合[16-17]。同源性分析顯示基因在不同物種間保守性較高，其中與蝦夷扇貝的相似性為70%，進(jìn)化樹分析顯示兩者聚為一支，表明兩者遺傳上關(guān)系較近，同屬于軟體動物這一類別。

為進(jìn)一步探討的功能，我們檢測了在馬氏珠母貝中不同組織中的表達(dá)量情況，發(fā)現(xiàn)在鰓中表達(dá)量最高，其次是肝胰腺和性腺。Christine等[18]的研究表明在腮腺組織中高表達(dá)，高表達(dá)有利于傷口修復(fù)。軟體動物的鰓和人類的皮膚一樣，是抵御有害環(huán)境的主要防御屏障。馬氏珠母貝的鰓直接與環(huán)境接觸，對水中的細(xì)菌和有害物質(zhì)起到過濾作用[19]。鰓具有豐富的毛細(xì)血管，能促進(jìn)血管舒張，鰓中還具有各種抗菌活性成分，并能進(jìn)行多種酶類分子的合成、某些應(yīng)激反應(yīng)等過程[20]。在馬氏珠母貝鰓中高表達(dá)，推測其可能在抵抗各種外界環(huán)境刺激時(shí)發(fā)揮了作用，但具體的功能仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。在性腺中的高表達(dá)表明與生殖細(xì)胞的成熟過程、減數(shù)分裂密切相關(guān)[21]，這與在縊蟶各組織中的相對表達(dá)一致[11]。貝類沒有特異性免疫，肝胰腺可分泌各種免疫酶來對抗外來物的干擾[22]。筆者推測，在貝體受到外界刺激后，激活GRK2或β-arrestin2通路，促進(jìn)肝胰腺分泌免疫酶來對抗外界刺激，這進(jìn)一步說明了肝胰腺在貝類先天性免疫中的作用。

在免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用。在人體中，能調(diào)解支氣管擴(kuò)張、血管舒張和促進(jìn)去甲腎上腺素釋放[23]。在炎癥反應(yīng)中，使新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞中的 IL-6 和 TNF-α升高[24]。TNF-α即腫瘤壞死因子-α，主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，作為一種內(nèi)源性致熱源，它能夠促使發(fā)熱，引起細(xì)胞凋亡；IL-6 是白細(xì)胞介素的一種，其作為促炎細(xì)胞因子和抗炎性肌球蛋白起作用[25]。在縊蟶水管損傷修復(fù)過程中，表達(dá)量的上升與介導(dǎo) TNF-α和 IL-6 的合成并在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了基因的全長，預(yù)測的cDNA全長是2 426 bp，包括開放閱讀框（ORF）2091 bp，編碼696個(gè)氨基酸，5′UTR長144 bp，3′UTR長191 bp，預(yù)測分子質(zhì)量79.0 ku，理論等電點(diǎn)9.18。蛋白為親水蛋白，N-端不存在信號肽，具有7個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)域。多重序列比對結(jié)果表明在不同物種間的保守性較高。NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，馬氏珠母貝與蝦夷扇貝聚為一簇，與蝦夷扇貝的親緣關(guān)系最近。qRT-PCR結(jié)果表明，基因在各組織中均有表達(dá)，在鰓中表達(dá)量最高，在肝胰腺和性腺中表達(dá)量也較高。

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Molecular Characterization and Expression Analysis ofAdrenergic Receptor () from

ZHANG Yu-ting1, ZENG Man-yu1, Ma Jia-yi1, Li Jia-xin1, JIAO Yu1,2, DU Xiao-dong2

（1./ 2.,524088,）

【Objective】To study the biological function of（）. 【Methods】The full length ofgene was cloned using rapid amplification of cDNA end technology（RACE）and its sequence characteristics were analyzed. Meanwhile, the expression ofmRNA in different tissues ofwas detected by Real-time PCR（RT-PCR）.【Result and conclusion】It shows that the total length ofgene was 2 426 bp, including 2 091 bp of the open reading frame（ORF）which encoded 696 amino acids, a 5′ untranslated region of 144 bp and a 3′ untranslated region of 191 bp. The predicted molecular weight was 79.0 ku, and the isoelectric point was 9.18. Multiple sequence alignment results showed thatwas conservative among different species. Domain analysis showed that the amino acid sequence ofhad 7 typical transmembrane domains. In addition, qRT-PCR indicated thatwas expressed in all the detected tissues, and the highest expression level was in the gills, followed by hepatopancreas and gonads.

;; molecular characterization; expression analysis

Q954.4

A

1673-9159（2019）04-0108-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.016.2019.04.016

2019-04-01

國家自然科學(xué)基金（31672626）

張雨婷（1995－）女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。Email：zytgou@163.com

焦鈺，女，副教授，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。Email：jiaoyu1981@hotmail.com

張雨婷，曾嫚玉，馬佳儀，等. 馬氏珠母貝β2腎上腺素能受體（）分子特征和表達(dá)分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（4）：108-114.

（責(zé)任編輯:劉朏）