王 桓，程 凱，任 杰，李昱頡，游 敏，吳嬌娟，林 怡，彭 超，古春凌，楊守親

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

腧穴特異性是指腧穴相對于他穴或非穴所具有的形態(tài)結構，從而反映疾病及治療效應上的相對特異性，是當代針灸界研究的方向與熱點，本實驗主要選擇極泉和內(nèi)關兩穴進行研究?！额惤?jīng)》中記載:“手少陰，心經(jīng)也；手厥陰，心包絡經(jīng)也；經(jīng)雖分二，藏實一原；凡治病者，但治包絡之腧，即所以治心也，故少陰一經(jīng)，所以獨無腧焉。” 從所主病候來講，心包經(jīng)和心經(jīng)都常用于治療心、胸和本經(jīng)循行部位病癥等，為治療心臟疾病的高頻經(jīng)脈，均可作為治療心系疾病的首選。內(nèi)關穴作為治療心血管類疾病療效最為突出的穴位之一，據(jù)古代文獻記載，已成為心包經(jīng)中使用頻率最高的穴位[1]，而對心經(jīng)上腧穴治療心系疾病的研究卻相對較少。極泉穴為心經(jīng)脈氣所發(fā)，《外臺秘要》載:其“心痛, 渴而欲飲，為臂厥，是主心所生病者”，可作為心經(jīng)的代表穴位。心房顫動(Atrial fibriilation，Af)是最常見的心律失常之一，因此本實驗借助陣發(fā)性房顫大鼠模型，采用針刺預處理雙側(cè)“極泉”穴，與“內(nèi)關”穴治療后的房顫持續(xù)時間進行對比，同時探討“內(nèi)關”和“極泉”穴對房顫結構重構的作用機制，以此為兩穴的腧穴特異性研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

體質(zhì)量180～200 g的雄性清潔級健康Wistar大鼠40只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。實驗前于北京中醫(yī)藥大學實驗室(恒溫恒濕SPF級)適應性喂養(yǎng)1周，每籠6～8只分籠飼養(yǎng)，自由進食進水。

1.2 試劑

氯化鈉注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司，C18060606)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，30037517)；氯化乙酰膽堿(Ach，Bioruler，RH32383-5g)；無水氯化鈣(Calcium chloride anhydrous，Bioruler，RH45167-25G)；Cx40(Abcam，ab183648)；Marker(Bio-rad，161-0374)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2301)。

1.3 儀器

無菌針灸針(蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司，0.20 mm×13 mm)；哺乳動物類手術器械一套；BL-420S生物信號采集與分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。蛋白檢測實驗儀器：穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(Bio-Rad，Powerpac HQ)；垂直電泳槽(Bio-Rad，MP3)；半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad，Trans-Blot SD)；計算機圖像分析儀(Image-Pro Plus Analysis Soft ware)；常溫高速離心機(eppendorf，5417C)；4℃低溫高速離心機(Thermo，MR 23i)；紫外分光光度計(eppendorf,Biophotometer)；微量加樣器(eppendorf Research plus)。Real time PCR實驗儀器：Real-Time PCR儀(ABI 7500)；數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(BINTA)。

2 方法

2.1 實驗分組

將體質(zhì)量均衡的大鼠用隨機數(shù)字表法進行隨機分組，分成正常組、模型組、內(nèi)關組和極泉組共4組，每組10只大鼠。

2.2 腧穴定位

腧穴定位根據(jù)大鼠的形態(tài)和解剖結構特點，參照《實驗針灸學》穴位標準定位如下。內(nèi)關：穴位位于前肢內(nèi)側(cè)，距腕關節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間；極泉：穴位位于腋窩頂點，腋動脈搏動處。

2.3 模型制備

采用陰莖經(jīng)脈注射Ach 66 μg/mL+CaCl210 mg/mL混合液(1 mL/kg，當日新鮮制備)進行造模，以心電圖出現(xiàn)典型Af改變者為造模成功，剔除造模前及造模過程中心電圖已出現(xiàn)異常、注射中死亡或造模未成功的大鼠。正常組經(jīng)陰莖經(jīng)脈注射生理鹽水(1 mL/kg)，模型組經(jīng)陰莖經(jīng)脈注射造模液，內(nèi)關組和極泉組在進行針刺預處理后經(jīng)陰莖經(jīng)脈注射造模液。上述每組各10只大鼠，每日注射1次，連續(xù)7天進行造模。

2.4 處理方法

隨機稱重各組大鼠，后計算其造模液注射量并于當日新鮮配置。正常組：予捆綁20 min后麻醉，經(jīng)陰莖經(jīng)脈注射生理鹽水；模型組：予捆綁20 min后麻醉，經(jīng)陰莖經(jīng)脈注射造模液造模；內(nèi)關組：以0.20 mm×13 mm規(guī)格無菌針灸針直刺雙側(cè)內(nèi)關穴；極泉組：以0.20 mm×13 mm規(guī)格無菌針灸針直刺雙側(cè)極泉穴，以針柄可見輕顫為度。兩組針刺預處理組均行針1 min，以30 r/min輕微捻轉(zhuǎn)，10 min后行針第2次，共留針20 min，每日1次，共7天，針刺預處理結束后麻醉，經(jīng)陰莖經(jīng)脈注射CaCl2-Ach混合液進行造模。

2.5 大鼠房顫持續(xù)時間記錄

將處理結束后的大鼠以5 mL/kg腹腔注射7%水合氯醛進行麻醉，待大鼠昏迷將其仰臥位固定于桌面，用針形電極刺入已消毒的四肢，描記大鼠正常心電圖后(記錄標準肢體導聯(lián))見圖1，經(jīng)陰莖靜脈以1 mL/kg注射CaCl2-Ach混合液。心電圖以P波消失且出現(xiàn)典型的f波為房顫發(fā)生標志，以f波消失、P波出現(xiàn)恢復竇性心律為房顫終止,見圖2，記錄每日房顫持續(xù)時間。

圖1 正常大鼠心電圖

圖2 造模后房顫大鼠心電圖

2.6 大鼠心房肌Cx40蛋白表達檢測

2.6.1 蛋白提取及定量 將心房肌組織從液氮取出，于預冷的研缽中快速研磨成粉末。將50 μL細胞裂解液加入預冷EP管，放入組織粉末，冰上孵育20 min后以4℃ 10 000 r/min離心10 min。將上清移至另一預冷的EP管中，BCA法測定蛋白含量后，將剩余蛋白樣品加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水中煮5 min。

2.6.2 Western blot實驗 ①配制10%SDS-PAGE分離膠溶液，加入5%濃縮膠,取40 μg 蛋白量的組織總蛋白樣品及蛋白質(zhì)分子量Marker，按1∶4體積比加入5×樣品緩沖液，以1×樣品緩沖液配平上樣體積后，沸水浴5 min;②電泳初始電壓為80 V，待溴酚藍染料的前緣進入分離膠上緣后提高電壓至100 V，至溴酚藍泳出分離膠下緣結束;③采用半干電轉(zhuǎn)移儀進行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，恒流30 mA，電轉(zhuǎn)90 min;④5%TBS-T脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min;⑤一抗孵育(稀釋比例1∶2 000);⑥二抗孵育(稀釋比例1∶2 000);⑦PVDF膜置ECL混合液中于室溫下振蕩溫育5 min，置于X光片盒中感光顯影;⑧用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進行灰度分析。

2.7 大鼠心房肌Cx40 mRNA表達檢測

2.7.1 總RNA提取 目的基因RT-PCR的檢測引物見表1。

表1 引物序列

2.7.2 反轉(zhuǎn)錄 將RNA 5 μL、Oligo(dT)2 μL、dd H2O(DEPC處理)4.5 μL加入離心管中，先42℃孵育60 min，后70℃孵育10 min。

2.7.3 RT-PCR 將cDNA 2 μL、引物1(10 pmol/μL)0.5 μL、引物2(10 pmol/μL)0.5 μL、SYBR mix 10 μL、dd H2O 7 μL同所得的cDNA一起加入離心管中混勻。Real-Time PCR程序設置為94℃預變性10 min，(94℃ 15 s，60℃ 60 s)×35個循環(huán)，72℃ 10 min。

2.7.4 PCR產(chǎn)物分析 用相對定量2-ΔΔCT分析法計算各個樣本目的基因的表達變化。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠房顫持續(xù)時間比較

大鼠連續(xù)注射造模液7天后，與正常組比較，模型組大鼠房顫持續(xù)時間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較，內(nèi)關組、極泉組大鼠的房顫持續(xù)時間均縮短(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 造模7天后各組大鼠房顫時間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖3 造模7天后各組大鼠房顫時間比較圖

3.2 各組大鼠心房肌Cx40蛋白表達結果比較

與正常組比較，Cx40蛋白在模型組表達增高(P<0.01);與模型組比較，大鼠經(jīng)過1周針刺預處理后，Cx40蛋白表達水平在內(nèi)關組、極泉組均下調(diào)(P<0.01)。見表3、圖4～5。

表3 各組大鼠心房肌Cx40蛋白相對表達量比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖4 各組大鼠心房肌Cx40蛋白相對表達量比較圖(n=3)

圖5 Western blot檢測各組大鼠心房肌Cx40蛋白條帶

3.3 各組大鼠心房肌Cx40 mRNA表達結果比較

各組大鼠心房肌Cx40 mRNA相對表達量見圖6，結果顯示，正常組、模型組、經(jīng)過1周針刺預處理的內(nèi)關組和極泉組，各組間無顯著差異。

圖6 各組大鼠心房肌Cx40 mRNA相對表達量比較

4 討論

房顫是最常見的心律失常之一，幾乎可在所有的器質(zhì)性心臟病中發(fā)生。目前認為,房顫是多種機制共同作用的結果，其中以Wijffels在1995年提出的“房顫引發(fā)房顫”的心房電重構和“第二因子學說”心房結構重構為參與房顫過程的主導理論[2]。心房的結構重構主要表現(xiàn)在房顫過程中心房肌的纖維化影響了心房肌縫隙連接蛋白(connexin，Cx)的表達量和分布，造成細胞間電信號傳導通路受阻，房顫易感性增高[3]。相關研究證明，Cx40蛋白表達量和Cx40 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)是心房結構重構過程中的主要參與者，可促進折返的發(fā)生[4-5]。

本實驗結果顯示，經(jīng)過1周造模后，模型組的Cx40蛋白表達量較正常組明顯升高，說明房顫的發(fā)生機制確與縫隙連接蛋白Cx40的表達水平有關；與模型組比較，內(nèi)關組和極泉組的Cx40蛋白表達量下調(diào)，體現(xiàn)了針刺預處理對房顫發(fā)生的拮抗作用。但在對Cx40 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的探究中，各組結果并無顯著差異，說明房顫大鼠Cx40蛋白在基因?qū)用娴谋磉_變化不明顯。從房顫持續(xù)時間的比較來講，大鼠連續(xù)注射造模液1周后，與正常組比較，模型組大鼠房顫持續(xù)時間顯著延長，說明造模成功；與模型組比較，內(nèi)關組、極泉組大鼠的房顫持續(xù)時間均縮短，說明極泉穴與內(nèi)關穴在房顫的發(fā)生中均起到防治作用。值得一提的是，本實驗對常用的經(jīng)尾靜脈注射Ach 66μg/mL+CaCl210 mg/mL混合液誘發(fā)大鼠房顫的造模方式[6]進行了操作上的改善，在造模液配制方法及劑量不變的情況下改經(jīng)陰莖經(jīng)脈注射后，造模效果與原方案無差異，操作流程上相對更簡便。

臨床及實驗研究表明，針刺療法在房顫的治療中療效顯著，相對于單純的藥物治療如胺碘酮更優(yōu)[7-8]，被患者普遍認可接受。本實驗所采用的針刺預處理手段，即在發(fā)病前施用針刺治療，體現(xiàn)了中醫(yī)“治未病”的預防醫(yī)學理念。現(xiàn)代臨床及實驗研究均證實，預先針刺可以達到阻抑隨后疾病對機體組織器官損傷的作用[9-11]。而在心律失常領域中，對于針刺預治療房顫的療效迄今鮮有人涉足，房顫的發(fā)生往往突發(fā)無征兆性，因此本實驗的設計對于充分發(fā)揮針刺在防治房顫中的作用將大有裨益。且針灸治療房顫具有價格低廉、操作安全簡捷等優(yōu)點，有重要的臨床應用價值，值得被進一步推廣。

內(nèi)關穴為手厥陰經(jīng)之絡穴，又是八脈交會穴之一，根據(jù)《針灸甲乙經(jīng)》描述“心系實則心痛,虛則為煩心,取之兩筋間；心憚憚而善驚恐，心悲，內(nèi)關主之”，主治心痛、心悸，有寧心、安神、定悸。亦有大量現(xiàn)代臨床和實驗研究證明，內(nèi)關穴在降低心率、恢復節(jié)律方面有正向調(diào)節(jié)作用，在治療房顫時有較顯著療效[12-14]。而選擇心經(jīng)的極泉穴與心包經(jīng)的內(nèi)關穴進行療效對比，一方面是基于“經(jīng)脈所過，主治所及”“寧失其穴，勿失其經(jīng)”的針灸基礎理論；一方面則是欲從極泉穴的近治作用與內(nèi)關穴的遠治作用角度進行腧穴特異性的比對分析。相對內(nèi)關穴而言，對極泉穴的研究在古籍經(jīng)典及現(xiàn)代實驗中都較少，與此穴居腋窩處不便于臨床進行針刺治療或許有關。然《靈樞·邪客》曰:“人有八虛……以候五藏……肺心有邪，其氣留于兩肘；肝有邪，其氣留于兩腋……凡此八虛者，皆機關之室，真氣之所過，血絡之所游?！睒O泉位于腋下，是八虛之一，為氣血運行的重要樞紐，其療效不可忽視。本實驗結果表明，極泉穴防治房顫的效果與內(nèi)關穴相當，且臨床已證實極泉穴具有改善心肌供血量[15]、緩解急性心絞痛[16]等作用，因而極泉穴治療心系疾病的作用機制有待現(xiàn)代醫(yī)學做出進一步的研究。

基于對內(nèi)關與極泉穴的療效分析，可以對心包經(jīng)和心經(jīng)的關系做進一步的探討。從經(jīng)脈循行的角度看，兩者的循行路線有著驚人的相似性；從兩經(jīng)上的穴位來看，數(shù)量相同，均為9穴；同節(jié)段穴位主治相近，如上臂近肩部手少陰經(jīng)的極泉與手厥陰經(jīng)的天泉均擅長治療心痛；如前臂腕部手少陰經(jīng)的神門與手厥陰經(jīng)的大陵均擅長治療失眠怔忡等神志問題。因此可以推測，心經(jīng)和心包經(jīng)，實為一經(jīng)[17]。古代文獻中有相關理論支撐，如六朝時《產(chǎn)經(jīng)》所載“手心主脈圖”中仍稱“心主者，內(nèi)屬于心”,且《太素·本輸》卷十一有言:“心出中沖……溜于勞宮……注于大陵……行于間使……入于曲澤……手心主經(jīng)也”，其中的中沖、勞宮、大陵、間使和曲澤現(xiàn)為心包經(jīng)五腧穴；現(xiàn)代研究亦表明，心經(jīng)與心包經(jīng)相關區(qū)域感覺神經(jīng)元的節(jié)段分布心臟感覺神經(jīng)元節(jié)段分布有重疊現(xiàn)象[18]，結合本實驗結果，也許可以為心經(jīng)和心包經(jīng)同屬一經(jīng)的猜想提供論證依據(jù)。

綜上，本實驗結果表明，針刺預處理極“泉穴”與“內(nèi)關”穴在縮短房顫持續(xù)時間的效果相當，其機制可能與下調(diào)房顫大鼠心房肌心房縫隙連接蛋白Cx40的表達有關，但并未影響到基因?qū)用娴谋磉_。本實驗旨在為房顫的臨床防治手段提供針刺治療新思路，并期未來對極泉穴的腧穴特異性、心經(jīng)及心包經(jīng)兩經(jīng)從屬關系的研究有進一步深入的探索。