翟思程，史亞軍，王景媛

1.陜西科技大學 鎬京學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046

復方龍脈寧(以下簡稱CL)方是陜西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病科陶根魚教授的經(jīng)驗方，處方由葛根、川芎、穿山龍、蜂膠(除去蜂蠟[1])四味中藥組成，在臨床應(yīng)用多年，治療氣滯-血瘀型冠心病效果顯著。雖然CL的活性成分有確切的藥理效應(yīng)，但作為需要長期口服的藥物，其有效成分的水溶性、脂溶性均較差，導致CL的生物利用度較低。文獻研究表明[2]，含羥基的有效成分與磷脂在一定條件下進行結(jié)合，得到磷脂復合物的理化性質(zhì)和生物特性與原化合物相比均有不同程度的改變，且磷脂復合物具有較強的親脂性，可以有效改善機體對藥物的吸收，具有顯著的生物有效性。本實驗將CL提取物與大豆卵磷脂進行復合，對CL提取物進行改性，對葛根中的葛根素、川芎中阿魏酸、穿山龍中薯蕷皂苷、蜂膠中的白楊素進行含量測定，對各成分含量進行加權(quán)，以加權(quán)結(jié)果E為指標，對CL復合物和提取物的基本性質(zhì)及離體腸吸收效果進行比較，為提高CL方的生物利用度提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV紫外分光光度計(日本島津公司)；高效液相色譜儀(Dionex Ultimate 3000)，Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；臺式離心機(Thermo Scientific Heraeus Labofuge 400R)；萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；磁力攪拌器(金壇市白塔金昌實驗儀器廠78-1)；真空干燥箱(上海欣齊科學儀器有限公司DZF-6050)。

1.2 試藥

葛根素對照品(批號：110773-201012，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院)；大豆卵磷脂(批號：040801，PC≥82%，上海太偉藥業(yè))；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水；烏拉坦(批號：75-01-03，上?；瘜W試劑采購供應(yīng)站)；CL提取物及CL磷脂復合物為自制；Krebs-Ringer’s液為自制。

1.3 實驗動物

SD大鼠(220±20)g 60只，SPF級，雌雄各半，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2014-0007，SPF級飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)，期間自由飲水、攝食，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，光照周期12L∶12D，通風良好。

2 方法與結(jié)果

2.1 CL提取物及磷脂復合物的理化性質(zhì)考察

2.1.1 色譜條件 1)葛根素的測定，流動相：甲醇-水(25∶75)；檢測波長：250 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；時間：25 min；進樣量：10 μL。2)阿魏酸的測定[3]，流動相：甲醇-0.1%磷酸水(30∶70)；檢測波長：321 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；時間：23 min；進樣量：20 μL。3)薯蕷皂苷的測定，流動相：乙腈-水(55∶45)；檢測波長：203 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；時間：13 min；進樣量：10 μL。4)白楊素的測定[4]，流動相：甲醇-0.1%磷酸水(64∶36)；檢測波長：268 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；時間：22 min；進樣量：30 μL。

2.1.2 CL磷脂復合物的制備及復合率的計算 稱取CL提取物[5]3 g，大豆卵磷脂9 g，加入無水乙醇500 mL，置于40 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌12 h，減壓回收乙醇，真空干燥，即得。前期實驗研究表明，CL提取物難溶于甲苯，而磷脂及CL磷脂復合物易溶于甲苯，利用這一特點，計算CL磷脂復合物的復合率。精密稱定M1(約1 g)CL磷脂復合物，加入20 mL甲苯，30 min內(nèi)每5 min強力振蕩一次，以完全溶解其中的磷脂及復合物，以3000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，取清液轉(zhuǎn)移至已恒重的蒸發(fā)皿中，減壓回收甲苯，稱定質(zhì)量M2。

復合率(%)=[M2-(M1-M2)×λ]/M1×100

(1)

式中：M1為磷脂復合物質(zhì)量，M2為磷脂復合物溶于甲苯的質(zhì)量，λ為磷脂與藥物質(zhì)量比，計算出CL磷脂復合物的復合率為86.72%。

2.1.3 對照品溶液的制備 1)葛根素對照品溶液的制備：精密稱取葛根素對照品12.8 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL，制成對照品儲備液。精密吸取儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容得質(zhì)量濃度為51.2 mg·L-1的葛根素對照品溶液。分別進樣4、8、10、12、16、20 μL對照品溶液，以葛根素峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=964 725X+46 102，r=0.998 6(n=6)，表明葛根素在0.20～1.02 μg線性關(guān)系良好。2)阿魏酸對照品溶液的制備：精密稱取阿魏酸對照品16.6 mg，用70%甲醇溶解，定容至25 mL，得到對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為66.4 g·L-1的對照品溶液。分別進樣4、8、10、12、16、20 μL，以阿魏酸峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y=23 381X-11 505，r=0.999 7(n=6)。表明阿魏酸在0.27～1.33 μg線性關(guān)系良好。3)薯蕷皂苷對照品溶液的制備：精密稱取薯蕷皂苷對照品3.75 mg，用乙腈溶解，定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為0.375 g·L-1的對照品溶液。分別進樣4、8、10、12、16、20 μL，以薯蕷皂苷峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y=55 548X-2397，r=1.000(n=6)。表明薯蕷皂苷在1.50～7.50 μg線性關(guān)系良好。4)白楊素對照品溶液的制備：精密稱取白楊素4.0 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，得到對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為40 mg·L-1的對照品溶液。分別進樣1、3、5、7、9 μL，以峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y=23 649X-16 319，r=1.000(n=5)。表明白楊素在0.04～0.36 μg線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學試驗 專屬性試驗顯示，葛根素、阿魏酸、薯蕷皂苷和白楊素分離良好，在空白樣品處無吸收，專屬性良好。精密度試驗顯示，葛根素、阿魏酸、薯蕷皂苷和白楊素峰面積RSD均小于2%，儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 紫外光譜分析 取適量CL提取物、磷脂、磷脂復合物以及與復合物配比相同的提取物與磷脂的物理混合物，分別溶解于無水乙醇，以無水乙醇為空白，對各樣品在200～400 nm用紫外光譜進行全波長掃描，結(jié)果見圖1。

注：A.磷脂；B.CL提取物；C.CL磷脂復合物；D.CL提取物與磷脂的物理混合物。圖1 紫外吸收圖譜

由紫外圖譜可知，磷脂在掃描范圍內(nèi)沒有吸收，而CL提取物、復合物和物理混合物的紫外吸收光譜最大吸收均在253 nm左右，且形狀相似。

2.1.6 CL提取物與磷脂復合物溶解性的比較 分別稱取過量CL提取物、CL提取物與大豆卵磷脂的物理混合物、CL磷脂復合物于水或正辛醇的具塞錐形瓶中，置于37 ℃恒溫水浴搖床中，充分振蕩48 h，使各樣品充分溶解并達到飽和。取出后以3000 r·min-1的速率離心10 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，采用HPLC分別測定3份樣品中葛根素、阿魏酸、薯蕷皂苷、白楊素的含量，按2.1項下色譜條件進樣分析，得到CL提取物中各成分含量比值為葛根素∶阿魏酸∶薯蕷皂苷∶白楊素=8∶1∶0.5∶0.5。實驗以各成分含量比值為權(quán)重系數(shù)，對各成分含量測定結(jié)果進行加權(quán)，計算E值。樣品在水和正辛醇中的表觀溶解度見表1～2。

E=(8K1+K2+0.5K3+0.5K4)/10

(2)

K1、K2、K3、K4分別代表葛根素、阿魏酸、薯蕷皂苷、白楊素的值。

表1 樣品在水中的表觀溶解度 g·L-1

表2 樣品在正辛醇中的表觀溶解度 g·L-1

加權(quán)結(jié)果表明，磷脂復合物中各成分在水中的表觀溶解度是提取物中各成分的5.24倍，提取物與磷脂的物理混合物中各成分在水中的表觀溶解度是提取物中各成分的3.32倍；磷脂復合物中各成分在正辛醇中的表觀溶解度是提取物中各成分的44.56倍，提取物與磷脂的物理混合物中各成分在正辛醇中的表觀溶解度是提取物中各成分的35.38倍。

2.1.7 CL提取物與磷脂復合物表觀油水分配系數(shù)的確定 分別于100 mL容量瓶中配制一定濃度的CL提取物及其磷脂復合物的水溶液，充分溶解后，分別精密移取20 mL于100 mL磨口錐形瓶中，再精密移取20.0 mL水飽和正辛醇，加塞封口，于37 ℃恒水浴搖床中以100 r·min-1的速度連續(xù)振搖24 h，分別精密移取水層和正辛醇層溶液2 mL，測定各成分含量，得到E值，計算水層中各成分濃度ρw，正辛醇層中各成分濃度為ρo，實驗及結(jié)果見表3。

表觀油水分配系數(shù)P=ρo/ρw

(3)

從結(jié)果可知，CL磷脂復合物中的各成分的油水分配系數(shù)比提取物中的提高了1.56倍。

2.2 CL提取物及磷脂復合物的離體腸吸收研究

本研究采用大鼠離體腸囊外翻法，觀察CL提取物與磷脂復合前后各成分從外翻小腸囊黏膜側(cè)向漿膜側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運量的變化，以此為依據(jù)評價小腸對CL改性前后的吸收作用。

2.2.1 Krebs-Ringer’s液(K-R液)的制備 NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl2·6H2O 0.043 g、D-Glucose 1.4 g，加蒸餾水稀釋至1000 mL。

2.2.2 空白腸液的制備和樣品處理方法 1)空白腸液的制備，按2.2.5項下方法制作“外翻小腸腸囊”模型，但腸囊內(nèi)外均只放置空白K-R液，實驗結(jié)束時一次性收集空白腸液2 mL。2)樣品處理方法，取200 μL空白腸液或含藥腸液，加入等量的6%高氯酸溶液，旋渦振蕩2 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液即得空白腸液或含藥腸液的待測樣品，取20 μL進樣進行檢測。

2.2.3 方法學考察 專屬性試驗顯示，按2.2.2項下方法處理空白腸液及分別加入葛根素、阿魏酸、薯蕷皂苷、白楊素加藥樣品，進行HPLC檢測，結(jié)果表明，腸液中的雜質(zhì)峰與檢測藥物峰分離良好，大鼠腸液中的內(nèi)源性雜質(zhì)對檢測結(jié)果無干擾，專屬性良好。精密度和回收率試驗結(jié)果表明，按2.2.2項下方法分別制備空白腸液，向空白腸液中分別加入高、中、低3個不同濃度點的葛根素、阿魏酸、薯蕷皂苷、白楊素溶液，按2.2.2項下樣品處理方法進行處理，每個濃度點平行配制5份，連續(xù)測定3 d，計算得各藥物的日內(nèi)及日間精密度RSD值均<5%，各藥物精密度良好，方法回收率良好。穩(wěn)定性試驗表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)。

2.2.4 標準曲線的制作 1)葛根素標準曲線的繪制，準確吸取0.5 mL大鼠空白腸液，置于2 mLEP離心管中，加入2.1.3項下葛根素對照品溶液0.5 mL，旋渦振蕩，按2.2.2項下方法行處理，按2.1.1項下色譜條件，分別進樣4、8、10、12、16、20 μL對照品溶液，以葛根素峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程Y=897 423X-16 701，r=0.999 3(n=6)，表明葛根素在0.10～0.51 μg線性關(guān)系良好。2)阿魏酸標準曲線的制備，準確吸取0.5 mL大鼠空白腸液，置于2 mLEP離心管中，加入2.1.3項下阿魏酸對照品溶液0.5 mL，旋渦振蕩，按2.2.2項下方法處理，按2.1.1項下色譜條件，分別進樣4、8、10、12、16、20 μL，以阿魏酸峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y=24 153X-10 502，r=0.999 7(n=6)，表明阿魏酸在0.14～0.67 μg線性關(guān)系良好。3)薯蕷皂苷標準曲線的制備，準確吸取0.5 mL大鼠空白腸液，置于2 mLEP離心管中，加入2.1.3項下的薯蕷皂苷對照品溶液0.5 mL，旋渦充分，按2.2.2項下方法處理，按2.1.1項下色譜條件，分別進樣4、8、10、12、16、20 μL，以薯蕷皂苷峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y=62 535X-5122，r=1.000 0(n=6)，表明薯蕷皂苷在0.75～3.75 μg線性關(guān)系良好。4)白楊素標準曲線的制備：準確吸取0.5 mL大鼠空白腸液，置于2 mL EP離心管中，加入2.1.3項下的白楊素對照品溶液0.5 mL，旋渦振蕩，按2.2.2項下方法處理，按2.1.1項下色譜條件，分別進樣1、3、5、7、9 μL，以峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸，得回歸方程：Y=25 144X-16 229，r=0.996 1(n=5)。表明白楊素在0.02～0.18 μg線性關(guān)系良好。

2.2.5 大鼠離體腸囊外翻模型的制備 大鼠禁食不禁水12 h，用4%烏拉坦腹腔注射麻醉(2.0 mL·kg-1)，沿腹中線剪開腹腔，取從幽門處起始15 cm段小腸(十二指腸)，置于裝有37 ℃的K-R液培養(yǎng)皿中，通入氧氣。向小腸中注入K-R液充分排除小腸腔中內(nèi)容物，再將小腸腔完全翻轉(zhuǎn)，使得小腸的黏膜側(cè)朝外，漿膜側(cè)朝內(nèi)[6]。小腸的一端用無血管損傷縫線結(jié)扎至不漏液，另一端接注射器的圓鈍端口，扎牢，接上取樣器，往腸腔內(nèi)定量注入2 mL的K-R液，將腸囊垂直置于含質(zhì)量濃度均為5 mg·mL-1的CL提取物改性前后的300 mL、37 ℃K-R液的錐形瓶中，并使小腸囊內(nèi)外的液面相平。采用磁力攪拌器在37 ℃下恒溫攪拌，并充分通氧，分別于第15、30、45、60、90、120、150、180、240、300 min，取30 μL的腸腔內(nèi)液，同時補充同體積K-R液，按2.2.2項下方法處理待測樣品，取20 μL進樣，檢測葛根素、薯蕷皂苷、阿魏酸、白楊素的含量，計算E值，以E值為指標計算單位面積累積滲透量(Q)和穩(wěn)態(tài)透膜速率(Jss)。

根據(jù)公式(4)計算各個時間點CL磷脂復合物的Q(μg·cm-2)。

Q=CV/2πrL

(4)

式中，C為各個取樣點的腸漿膜側(cè)E值計算得出的CL質(zhì)量濃度(μg·mL-1)，V為腸囊內(nèi)液體積(2 mL)；r為小腸半徑(0.18 cm)，L為腸囊實際長度。

將以上各樣品的Q對滲透時間t進行回歸處理，根據(jù)公式(5)計算穩(wěn)態(tài)透膜速率Jss(μg·cm-2·h-1)。

Jss=(Q/t)×60

(5)

2.2.6 透膜吸收結(jié)果 不同時間段的Q見表4，不同時間段單位面積釋藥曲線見圖2。藥物透過小腸黏膜的藥物穩(wěn)態(tài)流量(Jss)，滯后時間和表觀滲透系數(shù)(Papp)結(jié)果見表5。

表4 不同時間段的 μg·cm-2

圖2 不同時間段單位面積釋藥曲線

由表4、5，圖2可知，CL提取物及磷脂復合物均能透過大鼠小腸黏膜，且磷脂復合物溶液在每個時間點透過的濃度高于提取物。前12 min每個樣品的接受池中均檢測不到藥物，證明每個樣品在滲透時均有一定的滯留時間。藥物的Q對時間呈良好的線性關(guān)系，符合一級動力學方程。最后300 min的Q為磷脂復合物>提取物。

3 結(jié)論

紫外光譜分析結(jié)果表明，CL提取物、復合物及提取物和磷脂的混合物的發(fā)色基團未發(fā)生改變，提示沒有形成新的化合物[7]；溶解性結(jié)果表明，CL磷脂復合物在水和正辛醇中的溶解性相較于CL提取物顯著提高，且高于CL提取物與磷脂的物理混合物，這表明CL磷脂復合物的復合不是簡單的物理混合。根據(jù)實驗結(jié)果，結(jié)合文獻研究[8]推測，CL磷脂復合物是由提取物中的羥基與大豆卵磷脂分子通過電荷遷移作用形成較為穩(wěn)定的化合物或絡(luò)合物，課題組將對CL磷脂復合物的結(jié)構(gòu)進行進一步研究。CL磷脂復合物既改善了CL提取物的水溶性又改善了脂溶性，水溶性的改善可能與復合物在水中形成膠團有關(guān)，脂溶性的改善可能是由于磷脂的極性部位與提取物相互作用，從而形成了一定的掩蔽作用。

CL提取物及其磷脂復合物中葛根素的表觀油水分配系數(shù)的結(jié)果表明，提取物與磷脂復合后可以提高葛根素的表觀油水分配系數(shù)，但因為形成磷脂復合物后葛根素的水溶性、脂溶性同時增強，所以表觀油水分配系數(shù)增加程度不顯著。

離體腸吸收結(jié)果表明，CL磷脂復合物溶液的累積滲透量和穩(wěn)態(tài)透膜速率都遠遠高于提取物溶液，主要原因是CL與磷脂復合后，磷脂復合物的水溶性、脂溶性同時得以大幅度提高。磷脂復合物透過大鼠十二指腸的滯后時間與提取物相比，明顯縮短，這是由于卵磷脂作為細胞膜的基本構(gòu)成，與細胞膜的親和力更強，其與有效成分結(jié)合可以使藥物更易透過細胞膜被肌體吸收。

研究結(jié)果表明，CL磷脂復合物既沒有改變原化合物的結(jié)構(gòu)，又顯著提高了CL的累計滲透量和穩(wěn)態(tài)透膜速率，透過小腸的滯后時間明顯縮短，這對提高CL方的生物利用度提供了理論支持。

表5 藥物穩(wěn)態(tài)流量與表觀滲透系數(shù)的測定