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桑枝多酚的制備與其抗氧化活性成分研究△

2019-07-13 03:16劉鑫彤孫登陽(yáng)葉世蕓唐崇明曹俊東周勝劉江云
中國(guó)現(xiàn)代中藥 2019年6期
關(guān)鍵詞:桑枝大孔黃素

劉鑫彤,孫登陽(yáng),葉世蕓,唐崇明,曹俊東,3*,周勝,劉江云

1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550002;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院 中藥系,江蘇 蘇州 215123;3.云南省第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部,云南 昆明 650032

桑屬植物桑MorusalbaL.是一種常用中藥,最初在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記錄,它的根也就是桑白皮,枝葉及果實(shí)等均可作為藥用。桑枝為桑的干燥嫩枝,《中華人民共和國(guó)藥典》中記錄了桑枝對(duì)于風(fēng)濕、關(guān)節(jié)病有一定療效,可用來(lái)治療濕痹浮腫的癥狀。眾多學(xué)者從其枝皮中分離出了黃酮類、生物堿類等化合物。已有實(shí)驗(yàn)表明,桑枝可以降壓、抗菌、明目,其藥理活性包括抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、心血管保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等[1]。

中國(guó)地大物博,是桑樹的產(chǎn)地之一,桑枝資源豐富、有深入開發(fā)利用的空間[1]。近年來(lái)對(duì)桑枝中生物堿、總黃酮等活性生物資源的研究與開發(fā)利用受到我國(guó)學(xué)者的關(guān)注[3-6]。本課題前期對(duì)桑枝中桑皮苷A、桑皮黃素兩種主要成分的含量分析方法進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)桑枝多酚的含量與具體品種、采收期有明顯關(guān)聯(lián)[7]。本文報(bào)道桑枝多酚的制備及其抗氧化作用,為桑枝的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀;ODS色譜柱(5C18-AR-Ⅱ,250 mm×4.6 mm,日本Cosmosil公司);BP-Purifier-100中壓液相系統(tǒng)(利穗科技蘇州有限公司);Avance Ⅲ plus 400 MHz核磁共振儀(德國(guó)Bruker Daltonics公司);UV-SPD-M20A紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);ME215S型電子天平(德國(guó)Starorious公司)。

1.2 試劑

AB-8等大孔樹脂(西安藍(lán)曉科技有限公司);硅膠300~400目(青島海洋化工有限公司);ODS硅膠(75 mm,日本Cosmosil公司);甲醇(色譜純,上?;瘜W(xué)試劑有限公司);純凈水;去離子水(自制);乙醇、過(guò)硫酸鉀、甲醇等其他試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

桑皮苷A對(duì)照品(純度97.2%)、桑皮黃素對(duì)照品(純度94.5%)由本實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)NMR、UV數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定,其純度采用液相峰面積歸一法計(jì)算;DPPH(1,1′-二苯基-2-三硝基苯肼)和ABTS(2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

桑枝(批號(hào):MA121010)于蘇州大學(xué)摘取,經(jīng)蘇州大學(xué)談建中教授鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的枝條,本實(shí)驗(yàn)選用已干燥的桑枝皮進(jìn)行研究。

2 方法

2.1 多酚的提取

取桑皮樣品500 g,75%乙醇回流提取2次,1.5 h/次,加醇量為5 L,將兩次濾液混合,減壓濃縮至250 mL(相當(dāng)于2.0 g生藥材/mL;MAP-1),上AB-8大孔樹脂柱(100 cm×10 cm),依次用水(5 L)、40%乙醇水(6 L)、90%乙醇水(10 L)洗脫(2 BV·h-1),分別收集洗脫液,減壓濃縮,干燥,分別得到相應(yīng)柘木多酚樣品MAP-2(2.3 g)、MAP-3(0.28 g)。

取MAP-2樣品1.5 g,用20%甲醇25 mL超聲溶解,上中壓C18反相柱(40 cm×7 cm),用20%甲醇洗脫(25 mL·min-1),檢測(cè)波長(zhǎng)為303 nm。收集色譜主峰1,并經(jīng)HPLC檢測(cè)純度,單體流分合并、濃縮干燥,得到化合物1(380 mg,純度90.2%)。

取MAP-3樣品0.2 g,用68%甲醇5 mL超聲溶解,上中壓C18反相柱(40 cm×7 cm),用68%甲醇洗脫(25 mL·min-1),檢測(cè)波長(zhǎng)為303 nm。收集色譜主峰2,并經(jīng)HPLC檢測(cè)純度,單體流分合并、濃縮干燥,得到化合物2(44 mg,純度95.3%)。

2.2 桑枝多酚的大孔樹脂精制工藝

參考本課題組前期文獻(xiàn)方法[8],首先采用靜態(tài)法進(jìn)行大孔樹脂篩選。將8種樹脂處理后,取適量(相當(dāng)于干質(zhì)量1.0 g)放入錐形瓶中,加25 mL提取液,在恒溫振蕩箱中搖晃6 h(25 ℃、180 r·min-1)后,抽濾得濾液測(cè)定吸附率;飽和樹脂加25 mL 95%乙醇,相同條件下恒溫振蕩6 h,取解吸液用于液相檢測(cè)解吸附率。

采用動(dòng)態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn),優(yōu)化AB-8大孔樹脂洗脫工藝。稱取相當(dāng)于4.0 g干質(zhì)量的AB-8濕樹脂裝柱(20 cm×1.5 cm,10 mL·BV-1),取樣品提取液適量上樣,用適量設(shè)計(jì)的待考察乙醇濃度、體積洗脫,流速為0.5 mL·min-1,5 mL收集一次,HPLC測(cè)定流出液中桑皮苷A、桑皮黃素的含量。

HPLC條件:流動(dòng)相:乙腈(A)-1%乙酸水(B),梯度洗脫(0~15 min,7%A;15~30 min,7%~43%A;30~45 min,43%A;45~50 min,43%~70%A);檢測(cè)波長(zhǎng)為303 nm;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量為20 μL[7]。采用峰面積(Y)和樣品質(zhì)量濃度(X,mg·mL-1)進(jìn)行含量計(jì)算,桑皮苷A和桑皮黃素的線性方程分別為Y=8 110.3X-21.429(0.101 5~2.029 mg·mL-1,r=0.999 8)、Y=9 849.3X+81.679(0.020 42~0.408 4 mg·mL-1,r=0.999 7)。

2.3 抗氧化活性測(cè)試

參照本課題組前期文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行,以維生素C作對(duì)照。各測(cè)試樣品溶液質(zhì)量濃度為0.1~1.0 mg·mL-1;桑皮苷A和維生素C為0.01~0.1 mg·mL-1。用分光光度計(jì)測(cè)定DPPH·(517 nm)或ABTS·(734 nm)的吸光度Ai。并按下列公式計(jì)算各樣品對(duì)自由基的清除率。

自由基清除率(%)=[1-Ai/Ab]×100

(1)

其中Ai為加入樣品反應(yīng)后溶液的吸光度值,Ab為未加樣品的DPPH·或ABTS·工作液的吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 多酚主成分鑒定

按上述方法制得桑枝多酚MAP-1~3。MAP-2、3再各經(jīng)中壓反相色譜柱進(jìn)一步分離,分別獲得化合物1、2。

化合物1:暗紅色粉末,易溶于甲醇、水等溶劑。

1H-NMR(CD3OD,400 MHz):δ7.43(1H,d,J=8.4 Hz,H-6),7.34(1H,d,J=16.4 Hz,H-α),6.95(1H,d,J=16.4 Hz,H-β),6.63(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-5),6.61(2H,m,H-2′,6′),6.60(1H,m,H-3),6.46(1H,dd,J=2.0,2.0 Hz,H-4′),4.91(1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),4.88(1H,d,J=7.8 Hz,H-1?)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz) :δ120.4(C-1),150.1(C-2),105.1(C-3),156.9(C-4),108.5(C-5),128.4(C-6),127.8(β-C),126.0(α-C),142.0(C-1′),107.3(C-2′),159.6(C-3′),104.1(C-4′),157.1(C-5′),108.1(C-6′),102.3(C-1″),102.5(C-1?),74.9(C-2″,2?),78.1(C-3″,3?),71.5(C-4″,4?),78.2(C-5″,5?),62.6(C-6″,6?)。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10]對(duì)照一致,鑒定為桑皮苷A。結(jié)構(gòu)參見圖1。

化合物2:黃色粉末。

1H-NMR(CD3OD,400 MHz):δ7.07(1H,d,J=2.0 Hz,H-3′),6.42(2H,brs,H-5′,6′),6.23(1H,s,H-6),5.21(1H,t,J=7.2 Hz,H-17),5.16(1H,t,J=7.2 Hz,H-12),3.58(2H,d,J=7.2 Hz,H-16),3.10(2H,d,J=7.2 Hz,H-11),1.60,1.59,1.58,1.54(each 3H,s,H-20,15,19,14)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz):δ157.9(C-2),121.5(C-3),184.1(C-4),157.1(C-5),99.0(C-6),163.9(C-7),107.6(C-8),162.6(C-9),103.9(C-10),24.8(C-11),123.4(C-12),132.6(C-13),17.5(C-14),25.8(C-15),22.4(C-16),123.0(C-17),132.0(C-18),17.7(C-19),25.9(C-20),113.7(C-1′),160.7(C-2′),105.5(C-3′),161.2(C-4′),107.9(C-5′),132.4(C-6′)。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致,鑒定為桑皮黃素。參見圖1。

圖1 桑皮苷A(1)和桑皮黃素(2)結(jié)構(gòu)

3.2 桑枝多酚的大孔樹脂制備工藝研究

大孔樹脂的吸附性和其化學(xué)物理性質(zhì)有關(guān),例如結(jié)構(gòu)、比表面積等。選用8種常用大孔樹脂進(jìn)行篩選。其對(duì)桑皮苷A和桑皮黃素的吸附特點(diǎn)見表1。

表1 桑枝提取液中2種主成分的靜態(tài)吸附和解吸附數(shù)據(jù)

由表1可知,所測(cè)試各型樹脂中,非極性(D101、LX-60)、弱極性(AB-8、LX-68G)樹脂對(duì)桑皮苷A和桑皮黃素吸附效果均較好;而極性樹脂和中極性樹脂對(duì)其吸附效果相對(duì)較差。進(jìn)一步從解吸率分析,非極性樹脂均不如弱極性樹脂AB-8,其原因可能為桑皮苷A、桑皮黃素中的多酚類基團(tuán)容易和非極性、弱極性樹脂結(jié)合,因而吸附率高;解吸附時(shí)非極性樹脂由于與溶質(zhì)的分子間作用力強(qiáng),更難解吸附。綜合比較,最終優(yōu)選AB-8樹脂。

采用動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn),對(duì)AB-8樹脂柱純化桑枝多酚的制備工藝參數(shù)進(jìn)行考察和優(yōu)化,包括上樣液濃度和體積、洗脫液比例和體積等。其中,洗脫液中乙醇比例對(duì)兩種成分解吸附的作用見圖2。由圖可見,樹脂柱中吸附的桑皮苷A容易被20%~40%乙醇解吸附;桑皮黃素較難洗脫,60%~100%乙醇均有解吸附量。經(jīng)多個(gè)單因素考察試驗(yàn)研究,獲得優(yōu)化的制備工藝參數(shù):最佳上樣濃度和上樣體積為2.0 g生藥/mL共10 mL;洗脫劑選擇用水5倍體積洗去雜質(zhì),40%乙醇溶液4倍體積洗脫桑皮苷A,90%乙醇溶液6倍體積洗脫桑皮黃素。

圖2 洗脫劑中乙醇濃度與桑皮苷A及桑皮黃素動(dòng)態(tài)解吸附關(guān)系

采用液相分析,測(cè)定桑枝多酚MAP-1中桑皮苷A、桑皮黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.7%、7.63%。經(jīng)AB-8樹脂精制后,MAP-2中桑皮苷A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.5%,MAP-3中桑皮黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.8%。各樣品液相色譜見圖3。

3.3 抗氧化活性

使用DPPH、ABTS兩種分析方法,對(duì)桑枝多酚MAP-1~3、桑皮苷A、桑皮黃素的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定(對(duì)照品為維生素C)。各樣品對(duì)兩種自由基的IC50值見表2。桑枝多酚MAP-1~3、桑皮苷A、桑皮黃素均對(duì)DPPH、ABTS兩種自由基具有清除作用,其中桑皮苷A活性更強(qiáng),可能與其具有優(yōu)良的溶解性有關(guān)。

注:1.桑皮苷A;2.桑皮黃素。圖3 桑枝多酚MAP-1~3樣品HPLC圖

表2 各樣品對(duì)DPPH和ABTS自由基的半數(shù)清除率(IC50) mg·L-1

4 結(jié)論

桑枝中成分組成復(fù)雜,其中多酚類成分是其主要有效成分之一。桑枝及柘木等同科植物中富含桑皮苷A等白藜蘆醇類抗氧化活性成分[8],相關(guān)報(bào)道較為豐富[1,5-6,9];其他特征性的異戊烯基取代黃酮類成分組成復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多變,但相對(duì)含量低,報(bào)道較少[1]。本課題前期HPLC檢測(cè)結(jié)果表明,桑枝多酚中的主要成分為桑皮苷A和桑皮黃素[7]。本文進(jìn)一步報(bào)道其該成分分離鑒定過(guò)程和抗氧化活性測(cè)試結(jié)果,為相關(guān)研究工作提供參考。

桑枝多酚的提取和大孔樹脂精制工藝已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3-5],但主要以總黃酮、桑皮苷A為指標(biāo)成分進(jìn)行研究,桑皮黃素等弱極性成分在精制過(guò)程中的含量變化未見報(bào)道。為此,本文采用大孔吸附樹脂法,進(jìn)一步研究建立基于該2種主成分含量變化的桑枝多酚相關(guān)精制工藝參數(shù),為后期研究與開發(fā)利用提供參考。研究結(jié)果表明,分別采用40%、90%乙醇洗脫,可以制備獲得較高純度的桑枝多酚MAP-2~3,工藝簡(jiǎn)潔可行。在本實(shí)驗(yàn)研究中,還參考課題組前期研究方法[8],就AB-8樹脂對(duì)2種目標(biāo)產(chǎn)物的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(25 ℃條件下)成分進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型模擬最佳(r=0.999 8),表明吸附劑和吸附質(zhì)均是決定吸附速率的主要因素。對(duì)不同上樣液濃度時(shí)該2種成分的吸附等溫線進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,Langmuir(r>0.995)和Freundlich(r>0.986)吸附等溫線方程均適用于描述溶質(zhì)分子與樹脂作用的過(guò)程;Langmuir方程表明,2種溶質(zhì)在低、中壓力范圍內(nèi)AB-8樹脂的吸附均屬于單分子層吸附。

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