趙穎，路娟，柴瑞平，呂欣鍇，陳曦

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

琺菲亞(Pfaffia)，又稱巴西人參(Brazilian ginseng)，為莧科琺菲亞屬多年生草本植物[1]，全世界共約90個種[2]，主要分布在南美洲巴西等國家熱帶雨林地區(qū)。該屬植物主要藥用部位是根，有壯陽、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、治療潰瘍、風濕性關(guān)節(jié)炎和降血糖等功效，已有300多年應(yīng)用史，是當?shù)孛耖g一種重要藥用植物[3]。其中Pfaffiapaniculata(Martius)Kuntze和Pfaffiaglomerata(Sprengel)Pedersen，是這一種屬在巴西最商業(yè)化的藥用植物，均被稱為巴西人參[4-5]，文獻報道P.glomerata為巴西南部P.paniculata的代用品[4-5]。

琺菲亞的化學成分主要包括三萜及三萜皂苷類，甾酮、甾醇及其皂苷類[1]。此外，琺菲亞還富含多種氨基酸、維生素等[1，7]。其中蛻皮甾酮作為一種能夠增進機能的物質(zhì)[8]，是琺菲亞中最主要的植物蛻皮甾體[9]。有報道稱，蛻皮甾酮只在P.glomerata中存在[10]，并被用作鑒定該物種的標準。但實驗前期發(fā)現(xiàn)，蛻皮甾酮同樣存在于P.paniculata中。同時化學研究表明，在琺菲亞中含有超過其干質(zhì)量11%的皂苷成分[10]。為進一步對比P.glomerata和P.paniculata兩種琺菲亞化學成分的不同，筆者采用高效液相色譜法、比色法和氨基酸自動分析儀對琺菲亞中蛻皮甾酮、總皂苷和氨基酸的含量進行了測定，并考察了不同提取部位中蛻皮甾酮和總皂苷的含量差異，同時從外觀形態(tài)以及微觀結(jié)構(gòu)對P.glomerata和P.paniculata進行了初步的比較。

1 材料

1.1 儀器

Waters UPLC H-Class系統(tǒng)(含四元溶劑泵、自動進樣裝置、在線真空脫氣裝置、PDA檢測器、Empower2色譜工作站)；Cary100UV-Vis變溫紫外分光光度計(美國Agilent公司)，日立L-8900全自動氨基酸分析儀；AB265-S十萬分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；YS-10小型高速粉碎機(北京燕山正德機械設(shè)備有限公司)；DRYFAST實驗室隔膜泵(威伊真空設(shè)備有限公司)；GZX-9030MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HC-2518高速離心機(安徽中科中佳科學儀器公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(林茂科技有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器公司)；ASP200S浸蠟機、EG1150H包埋機、RM2245切片機、HI1210展片機、ST5020染色機(德國LEICA公司)；PS-53烤片機(日本SAKURA公司)。

1.2 試藥

Pfaffiaglomerata和Pfaffiapaniculata(寧波琺菲亞食品股份有限公司)；蛻皮甾酮(純度98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：180617)；人參皂苷Rb1(純度98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：171018)；乙腈(色譜純，美國Merk公司，CAS-No：75-05-8)；甲醇(色譜純，美國Merk公司，CAS-No：67-56-1)；無水乙醇、冰醋酸(北京化工廠，批號分別為：20170223、20170502)；高氯酸；屈臣氏蒸餾水(GB19298)；鹽酸(北京化工廠，批號：20170826)；苯酚、檸檬酸鈉、香草醛(國藥集團化學試劑，批號分別為：20171020、20170418、20161110)；石蠟(Leica，Lot.1411063)、L-天冬氨酸(Asp，批號：121027)、L-谷氨酸(Glu，批號：121107)、L-絲氨酸(Ser，批號：121109)、L-甘氨酸(Gly，批號：121024)、L-精氨酸(Arg，批號：121102)、L-蘇氨酸(Thr，批號：121126)、L-脯氨酸(Pro，批號：121031)、L-丙氨酸(Ala，批號：121105)、L-纈氨酸(Val，批號：121125)、L-異亮氨酸(Ile，批號：121013)、L-亮氨酸(Leu，批號：120929)、L-苯丙氨酸(Phe，批號：120922)、L-賴氨酸(Lys，批號：121126)、L-酪氨酸(Tyr，批號：121108)、L-組氨酸(His，批號：121030)均購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度≥98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 石蠟切片法比較藥材根形態(tài)學觀察

2.1.1 藥材外觀差異P.glomerata表面灰黃色，具縱皺紋，質(zhì)較硬，斷面淡黃白色。P.paniculata表面棕黃色，具縱皺紋，主根及支根有明顯的疣狀突出，質(zhì)稍硬，斷面棕黃色。見圖1。

注：A.P.glomerata；B.P.paniculata。圖1 P.glomerata和P.paniculata外觀形態(tài)觀察

2.1.2 藥材石蠟切片方法 取材→FAA固定液(50%乙醇-冰醋酸-福爾馬林，體積比90∶5∶5)固定1周→脫水(依次50%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇每級0.5～1 h)→透明(50%二甲苯+50%無水乙醇、純二甲苯每級2 h)→浸蠟機浸蠟→包埋→切片、貼片→展片→染色觀察。

2.1.3 石蠟切片結(jié)果 通過對P.glomerata和P.paniculata的根進行石蠟切片制作，并在顯微鏡下觀察了2種琺菲亞根的切片，進一步從解剖學上比較2種琺菲亞根組織結(jié)構(gòu)(見圖2)。

注：A.P.glomerata；B.P.paniculata；a.薄壁細胞；b.維管束；c.木質(zhì)部導管；d.韌皮部。圖2 P.glomerata和P.paniculata外觀形態(tài)觀察

通過觀察發(fā)現(xiàn)，P.glomerata薄壁細胞形狀相對規(guī)則，排列緊密有序；維管束結(jié)構(gòu)清晰，木質(zhì)部導管結(jié)構(gòu)可見。P.paniculata薄壁細胞形狀相對不規(guī)則，排列松散，維管束結(jié)構(gòu)較少。

2.2 HPLC測定藥材不同提取部位中蛻皮甾酮的含量

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取蛻皮甾酮對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的配制 將琺菲亞藥材P.glomerata和P.paniculata根部于粉碎機中粉碎為粗粉，精密稱取1 g于具塞錐形瓶，分別加入50 mL蒸餾水、50%乙醇水、75%乙醇水，稱定質(zhì)量，超聲40 min，冷卻，稱質(zhì)量，補足質(zhì)量，搖勻，分別取10 mL，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.2.3 色譜條件 采用Waters XBridge RP18色譜柱(250 nm ×4.6 mm，5 μm)，流動相A：乙腈，流動相B：水，梯度洗脫(0～17 min，3%～35%A；17～20 min，35%～75%A；20～25 min，75%～100%A)；流速0.8 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長265 nm；進樣量10 μL。在上述色譜條件下，色譜圖見圖3。

注：A.蛻皮甾酮對照品溶液；B.P.glomerata供試品水溶液；C.P.paniculata供試品水溶液。圖3 蛻皮甾酮對照品及琺菲亞供試品的HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項下蛻皮甾酮對照品溶液0.12、0.14、0.18、0.3、0.36、0.4 mL，分別置于2 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得系列對照品溶液，溶液過0.22 μm微孔濾膜，按2.2.3項下色譜條件進樣，測得峰面積。分別以蛻皮甾酮對照品峰面積值為縱坐標(Y)，蛻皮甾酮對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=8 176 297X-59 818，r=0.999 5。結(jié)果表明，蛻皮甾酮在62.82～209.4 mg·L-1線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 取蛻皮甾酮對照品溶液(98.46 mg·L-1)，按2.2.3項下色譜條件進行測定，重復6次，記錄色譜峰，計算得色譜峰面積的RSD值為1.8%，說明該儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取P.glomerata根部粗粉6份，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，2.2.3項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果蛻皮甾酮含量的RSD值為1.7%，表明本方法具有良好的重復性。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的P.glomerata根部粗粉6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入2.5 mg·mL-1蛻皮甾酮對照品溶液1 mL，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，2.2.3項下色譜條件進樣測定，結(jié)果平均回收率為98.1%，RSD為1.8%。

2.2.9 樣品測定 分別稱取P.glomerata和P.paniculata藥材根部粉末約1 g，平行3份，精密稱定，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2.3項下色譜條件進樣測定，計算樣品中各提取部位的蛻皮甾酮的含量，并采用t檢驗對結(jié)果進行差異顯著性分析。結(jié)果見表1。

表1 蛻皮甾酮含量測定結(jié)果 mg·g-1

注：與P.glomerata比，**P<0.01。

2.3 UV測定藥材中總皂苷的含量

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱定人參皂苷Rb1對照品5 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇定容即得。

2.3.2 供試品溶液的配制 分別精密稱取P.glomerata和P.paniculata根部粉末各2 mg于具塞試管中，加5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，搖勻，于100 ℃水浴中加熱20 min后取出，立即以冰浴冷卻5 min，加入冰醋酸8 mL搖勻，在540 nm處檢測吸光度值。

2.3.3 測定波長的選擇 取360 μL人參皂苷Rb1對照品溶液于具塞試管中，氮氣吹干，加5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，搖勻，于100 ℃水浴中加熱20 min后取出，立即以冰浴冷卻5 min，加入冰醋酸8 mL搖勻，立即在紫外分光光度計于400～800 nm波長下掃描，同時空白溶液作參比，對照品溶液在540 nm處有最大吸收，由此確定檢測波長為540 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液120、160、200、240、280、320、360、400、440 μL于試管中，氮氣吹干，加5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，搖勻，于100 ℃水浴中加熱20 min后取出，立即以冰浴冷卻5 min，加入冰醋酸8 mL搖勻，在540 nm處讀取吸光度值。以吸光度為縱坐標(Y)，以濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.027 6X-0.136，r=0.995 7。結(jié)果表明，總皂苷在13.03～43.44 mg·L-1線性關(guān)系良好。

2.3.5 樣品測定 分別稱取P.glomerata和P.paniculata藥材根部粉末約2 mg，平行3份，精密稱定，按照2.3.2項下方法制備供試品溶液，并計算樣品中各提取部位的總皂苷的含量，采用t檢驗對結(jié)果進行差異顯著性分析。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，2種琺菲亞藥材的總皂苷的含量存在顯著性差異。

表2 總皂苷含量測定結(jié)果 mg·g-1

注：與P.glomerata比，**P<0.01。

2.4 氨基酸自動分析儀測定藥材中15種水解氨基酸及總氨基酸的含量

2.4.1 色譜條件 分離柱：4.6 mm×60 mm標準分析柱，帶保護柱；磺酸型陽離子樹脂：No.2622，3 μm(日本日立公司)；反應(yīng)柱柱溫：135 ℃；分離柱柱溫：57 ℃；緩沖液流速0.4 mL·min-1，反應(yīng)液流速0.35 mL·min-1；檢測波長：第1通道570 nm，第2通道440 nm；進樣體積：20 μL。

2.4.2 混合氨基酸標準工作液的配制 精密稱取單個氨基酸對照品于同一50 mL燒杯中，用8.3 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液溶解，精密轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用水稀釋定容至刻度，混勻，得到濃度為1 μmol·mL-1的混合氨基酸對照品儲備液。準確吸取混合氨基酸對照品儲備液0.8 mL于10 mL容量瓶中，加pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液定容至刻度，混勻，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.4.3 供試品溶液的配制 分別精密稱取0.2 g的P.glomerata和P.paniculata藥材根部粉末于水解管中，加入10 mL的6 mol·L-1鹽酸溶液，滴入3滴苯酚，充氮后封管，置于(110±1)℃的電熱鼓風恒溫箱內(nèi)水解22 h后，冷卻至室溫，水解液過濾后用水定容至50 mL容量瓶中。準確吸取1.0 mL 濾液，N2吹干，pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液稀釋到5 mL，過0.22 μm微孔濾膜備用。

2.4.4 試樣的測定 混合氨基酸標準工作液和供試品溶液分別以相同體積注入全自動氨基酸分析儀，以外標法通過峰面積計算供試品溶液中氨基酸的含量(結(jié)果見表3)。

(1)

其中A：樣液峰面積，A0：標液峰面積，C標：標液濃度，V：樣品定容體積，m：稱樣質(zhì)量，f：稀釋倍數(shù)，X：被測物質(zhì)質(zhì)量濃度。

表3 藥材中15種水解氨基酸的含量 g·(100 g)-1

注：與P.glomerata比，**P<0.01。

3 討論

石蠟切片是用石蠟作為包埋劑的一種顯微制片方法，是植物顯微技術(shù)上最重要也是最常用的一種方法，在植物的解剖學及其相關(guān)領(lǐng)域的生產(chǎn)及科研中均有廣泛的應(yīng)用[12]，可用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領(lǐng)域的研究中。采用石蠟切片法制備得到的中藥材切片可永久保存。

蛻皮甾酮作為一種能夠增進機能的物質(zhì)[8]，是琺菲亞中最主要的植物蛻皮甾體[9]，有報道稱蛻皮甾酮只在P.glomerata中存在[10]，并被用作鑒定該物種的標準。但實驗結(jié)果表明，蛻皮甾酮同樣存在于P.paniculata中。在選擇色譜流動相時，分別對有機相(甲醇、乙腈)和水相(純水、甲酸水)的不同組合進行了考察，結(jié)果顯示，乙腈-水作為流動相，能夠使色譜峰達到完全分離，可以在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)基線分離。在樣品處理過程中，均將不同批次的樣品集中粉碎，混勻后稱取樣品，避免了由于藥材個體差異帶來的誤差；同時比較了超聲提取和回流提取2種不同提取方法，結(jié)果顯示，超聲提取與回流提取效果相似，考慮到操作的簡便性與實用性，最終選擇超聲提取。本文通過HPLC建立了快速測定琺菲亞中蛻皮甾酮的方法，該方法分離效果理想，重復性好。

有報道稱琺菲亞中主要的成分是皂苷[13]，為對比這2種琺菲亞皂苷成分的差異，實驗采用了比色法對比藥材各提取部位中總皂苷的含量。因目前國內(nèi)尚無法菲亞皂苷類成分的法定對照品，實驗選用了與琺菲亞皂苷類成分基本母核結(jié)構(gòu)接近的人參皂苷Rb1為對照品，結(jié)果表明，總皂苷的含量在不同種屬琺菲亞的不同提取部位中存在差異。

目前氨基酸檢測的研究方法有很多種[14-15]，包括分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法等。其中基于高效陽離子交換色譜-柱后茚三酮衍生法形成的全自動氨基酸分析儀是目前氨基酸檢測最常用的方法之一?，m菲亞化學成分研究表明，琺菲亞中含有多種氨基酸[7]，為進一步比較2種琺菲亞化學成分的差異，采用全自動氨基酸分析儀比較了2種屬氨基酸含量的差異。結(jié)果表明，P.paniculata所含的各氨基酸及總氨基酸含量均高于P.glomerata。

本實驗對2種琺菲亞形態(tài)學及主要的化學成分蛻皮甾酮、總皂苷、氨基酸的含量均進行了差異性的比較，結(jié)果表明，琺菲亞形態(tài)學差異明顯，蛻皮甾酮、總皂苷及氨基酸的含量存在顯著性差異，為琺菲亞藥材的質(zhì)量控制與評價提供了理論依據(jù)。