李海華，郭蔚冰，陳志強(qiáng)*，青梅，付麗云，張遠(yuǎn)達(dá)，蔡小利

1.內(nèi)蒙古華天制藥有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024070；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

抗生素類藥物在人類醫(yī)療行業(yè)[1]和動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)[2-3]中傳染病的預(yù)治方面有著重要作用，人類和動(dòng)物的醫(yī)療防治已經(jīng)離不開抗生素的使用。無限制地使用抗生素使得細(xì)菌為確保生存優(yōu)勢，產(chǎn)生和衍變耐藥基因[4]，進(jìn)而使得多重耐藥菌[5]得以生存并繁衍。多重耐藥菌的復(fù)雜性導(dǎo)致臨床感染性疾病難以治療。目前，許多國家已嚴(yán)禁抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用，但其給抗感染的治療帶來了一些不便。因此，如何選擇一種不產(chǎn)生耐藥性的抗菌藥物來替代或者減少抗生素的應(yīng)用成為當(dāng)今人們思考和研究的熱點(diǎn)。我國運(yùn)用中醫(yī)藥治療疾病歷史悠久，研究結(jié)果顯示[6-8]，一些中草藥及其活性成分確實(shí)具有抗菌、抑菌活性，可改善和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性，將這些中藥重新組方，制成制劑，開發(fā)新藥[9]，進(jìn)而為畜牧業(yè)中常見的大腸桿菌感染和其他細(xì)菌感染性疾病的防治研究提供有力的支撐。

1 材料

1.1 菌種來源

21株分離自鵝，7株分離自羊，15株分離自豬的致病性大腸桿菌，均購自于內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌(44102)購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與試劑

LDZX-75KBS立體式壓力蒸汽滅菌器、DH4000型電熱恒溫培養(yǎng)箱、MH瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物科技有限公司。

1.3 藥物

左氧氟沙星、鹽酸多西環(huán)素、硫酸安普霉素、鹽酸沙拉沙星、氨芐西林、恩諾沙星、乳酸諾氟沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、阿莫西林、硫酸慶大霉素和硫酸黏菌素均由內(nèi)蒙古華天制藥有限公司提供；白頭翁、板藍(lán)根、瓜蔞、茵陳、博落回、赤芍、馬齒莧、穿心蓮、苦參、梔子、水楊梅、訶子、大青葉、山豆根、丹參、地錦草、甘草、黃柏、黃芪、金銀花、龍膽草、青蒿、山楂、烏梅、五味子、黃連、仙鶴草、野菊花、八角茴香、柴胡、大黃、黨參、干姜、黃芩、藿香、荊芥、桔梗、千里光、連翹、蘆薈、石榴皮、益母草、淫羊藿、魚腥草和紫雛菊均購于安國市玉丞中藥材有限公司，并由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院青梅教授鑒定為正品。

2 方法

2.1 耐藥菌株篩選試驗(yàn)

參考《歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》操作規(guī)程，制備藥敏片。采用K-B法檢測43株病源大腸桿菌對13種抗菌藥的敏感性，觀察含藥濾紙片周圍有無抑菌環(huán)，直接測量其直徑，用(mm)記錄，參照《歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》中細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn)的“抗菌藥物的抑菌環(huán)與敏感標(biāo)準(zhǔn)”判定其敏感、中介和耐藥情況。按照藥敏試驗(yàn)結(jié)果(耐藥率≥70%)篩選多重耐藥菌株。

2.2 中藥提取方法

稱取上述45味中藥各50 g，加入500 mL 的蒸餾水浸泡2 h，微沸煎煮2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，濃縮至50 mL，生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，高壓蒸氣滅菌，備用。

2.3 大腸桿菌懸液制備

將多重耐藥菌株接種于肉湯培養(yǎng)管中，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲凭鷳乙?，?.9%氯化鈉溶液稀釋至濃度為105CFU·mL-1，備用。

2.4 中藥體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)

采用牛津杯法測定45味中藥提取液對大腸桿菌的抑菌直徑[9]，往直徑12 cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)倒入20～25 mL已滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，無菌條件下靜置凝固備用。用移液槍吸取100 μL大腸桿菌懸液注入已凝固的培養(yǎng)基上并涂布均勻，然后在培養(yǎng)皿上等距放置4個(gè)牛津杯，用移液槍往其中3個(gè)牛津杯分別注入100 μL藥材提取液，另一個(gè)加入同等體積的無菌0.9%氯化鈉溶液作為空白對照，將上述平皿放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，于37 ℃培養(yǎng)18～20 h，測量并記錄抑菌圈直徑。抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)是參照陳靜等[10]藥敏實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，以抑菌圈直徑>20 mm為高敏；抑菌圈直徑為10～20 mm為中敏；抑菌圈直徑<10 mm為不敏感。

2.5 中藥最小抑菌濃度的測定實(shí)驗(yàn)

采用試管二倍稀釋法，取12支試管為1組，置于試管架上，用移液搶吸取5 mL營養(yǎng)肉湯于每支試管內(nèi)，再另取移液管吸取5 mL中藥藥液(1 g·mL-1)于第1支試管內(nèi)，抽吸3次，使藥液與肉湯混勻，再從每組第1管吸取5 mL混勻液到每組2管中，如此類推一直到第11管，再從第11管中吸取5 mL混勻液舍去，第12管為細(xì)菌對照組，不加藥液。即每組試管中的藥液質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、0.000 5 g·mL-1。

將以上混勻液置于培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察混勻液是否發(fā)生渾濁，發(fā)生渾濁則判定為細(xì)菌增殖，不發(fā)生渾濁則判定為增殖受到抑制。細(xì)菌增殖受到抑制的最小藥物濃度即判定為該藥物的最小抑菌濃度(MIC)。以此測定各味中藥提取物對不同耐藥菌株的最小抑菌濃度。

3 結(jié)果

3.1 不同來源多重耐藥大腸桿菌對抗菌藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)43株來自于鵝源、羊源和豬源的大腸桿菌對13種抗生素類藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果中篩選出耐藥性較高并且多重耐藥的大腸桿菌7株，其藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

3.2 7株不同來源多重耐藥菌株對45味中藥的敏感性結(jié)果

以45味中藥提取液(1.0 g·mL-1)為研究對象，采用牛津杯法，考察其對7株不同來源的多重耐藥菌株的體外抑菌活性，測定抑菌圈直徑，統(tǒng)計(jì)表現(xiàn)為中敏和高敏中藥的抑菌圈直徑結(jié)果，見表2。部分中藥的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

注：A1、A2.赤芍；B1、B2.荊芥；C1、C2.黃柏；D1、D2.烏梅；E1、E2.水楊梅；F1、F2.黃芩；G.馬齒莧；H.訶子；J1、J2：山楂；K1、K2.博落回。圖1 部分中藥對3號(hào)大腸桿菌的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 10味高敏中藥最小抑菌濃度測定結(jié)果

從45味中藥中選取平均抑菌圈直徑大于20 mm(高敏)的中藥，共10味，作為研究對象，采用試管二倍稀釋法測定其對不同來源的多重耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度，結(jié)果見表3。

表1 7株不同來源多重耐藥的大腸桿菌對13種抗菌藥的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：0表示耐藥；1表示中介；2表示敏感。

表2 17味中藥對多重耐藥菌株的抑菌圈測定結(jié)果 mm

表3 10味高敏中藥的最小抑菌濃度結(jié)果 mg·mL-1

根據(jù)最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對10味中藥對不同來源(鵝、羊和豬)的多重耐藥菌的抑菌效果進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 10味中藥對不同來源耐藥菌株抑制作用

4 討論

4.1 耐藥菌株的耐藥性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)篩選出的7株不同來源的多重耐藥大腸桿菌對13種抗菌藥物的耐藥率均大于69.21%；其中來自于鵝源、羊源和豬源各有1株大腸桿菌的耐藥率已達(dá)到84.62%；實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的抗菌藥物均為畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中常用藥物，如此嚴(yán)重的大腸桿菌耐藥性的現(xiàn)狀，應(yīng)該與抗菌藥物在臨床的長期濫用相關(guān)。

恩諾沙星、多西環(huán)素、阿莫西林、氨芐西林對多數(shù)的多重耐藥菌株已幾乎無效，耐藥率達(dá)85.71%。這也是獸醫(yī)臨床部分細(xì)菌性疾病單一抗生素治療效果不佳的原因之一。同時(shí)也說明臨床致病大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性已十分嚴(yán)峻。

硫酸黏菌素對多重耐藥菌株仍有較好的抑制效果，有效率可達(dá)85.71%。其原因應(yīng)與硫酸黏菌素的作用機(jī)理有關(guān)。硫酸黏菌素可以與細(xì)胞膜脂蛋白游離磷酸鹽結(jié)合，使得細(xì)胞膜表面張力減小、通透性增加，導(dǎo)致胞漿外流、細(xì)胞死亡。其抗菌作用部位的特異性不高，不易產(chǎn)生耐藥性。

此外，以實(shí)驗(yàn)篩選出7株多重耐藥菌株作為研究對象具有一定代表性和重要意義。

4.2 7株不同來源多重耐藥菌株對45味中藥的敏感性結(jié)果分析

根據(jù)抑菌圈直徑大小分析可知，7株不同來源多重耐藥菌株對白頭翁、板藍(lán)根、穿心蓮、大青葉、丹參、地錦草、甘草、瓜蔞、黃芪、金銀花、茵陳、龍膽草、千里光、青蒿、仙鶴草、苦參、野菊花、梔子、大黃、黨參、干姜、藿香、連翹、蘆薈、益母草、淫羊藿、魚腥草和紫雛菊28味中藥表現(xiàn)為不敏感；對八角茴香、柴胡、黃芩、荊芥、桔梗、石榴皮和山豆根7味中藥表現(xiàn)為中敏；對博落回、山楂、水楊梅、赤芍、黃柏、五味子、烏梅、黃連、馬齒莧和訶子10味中藥表現(xiàn)為高敏。具有抑菌效果的17味中藥的抑制作用強(qiáng)弱依次為：博落回>黃連>水楊梅>烏梅>馬齒莧>訶子>黃柏>赤芍>山楂>五味子>柴胡、桔梗、石榴皮、黃芩、荊芥、山豆根、八角茴香；博落回、黃連、水楊梅的抑菌圈直徑分別可達(dá)35.3、32.2、27.2 mm，抑菌效果較理想。結(jié)果與大部分報(bào)道的結(jié)果一致[10-12]。其中，水楊梅抑制大腸桿菌增殖的效果鮮見報(bào)道。

4.3 10味高敏中藥最小抑菌濃度測定結(jié)果分析

10味中藥的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：體外抑菌效果最好的是博落回，平均最小抑菌濃度約為3.63 mg·mL-1；其次是黃連，平均最小抑菌濃度為8.37 mg·mL-1；第三是水楊梅，平均最小抑菌濃度為10.04 mg·mL-1；其他7味中藥平均最小抑菌濃度由小到大依次為：烏梅、馬齒莧、訶子、黃柏、赤芍、山楂和五味子；不同中藥最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其抑菌效果趨勢與測定抑菌圈直徑大小實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。不同中藥對來源于鵝、羊和豬的多重耐藥菌株抑制作用不同，同一中藥對不同來源的多重耐藥大腸桿菌的抑菌效果有所差別，但差別不顯著。結(jié)果說明中藥對大腸桿菌的增殖抑制作用機(jī)制不同于西藥抗菌藥物，中藥抑制大腸桿菌的作用具有非特異性，不易產(chǎn)生耐藥性。

4.4 中藥對于細(xì)菌性疾病的應(yīng)用前景分析

近幾年，中藥逆轉(zhuǎn)耐藥性的機(jī)制作為中藥抗菌研究的一個(gè)新的領(lǐng)域悄然興起，中藥具有抑制、延緩和消除細(xì)菌耐藥性的作用[13-15]，研究中藥單體[16]和中藥復(fù)方制劑[17-18]抑菌或逆轉(zhuǎn)耐藥性實(shí)驗(yàn)眾多，例如：陳靜等[10]對11味中藥對痤瘡丙酸桿菌的體外抑制作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，痤瘡丙酸桿菌對黃連高敏，對黃柏、黃芩、丹參、半枝蓮中敏。蘆亞君等[19]通過3種中藥方劑逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性的實(shí)驗(yàn)證明了三黃湯、黃連解毒湯和五味消毒飲有逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的作用。除了上述實(shí)驗(yàn)研究，還有許多研究結(jié)果均證明，部分中藥及中藥制劑對其他菌種，如金黃色葡萄球菌[11]、嗜水氣單胞菌[20]、肺炎克雷伯菌和真菌[21]等不同種類和不同來源[12，22-24]的致病菌和耐藥菌均具有較理想的抑制作用。同時(shí)，中藥還具有療效好、毒副作用小、價(jià)格低廉、制備工藝簡便、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在未來勢必會(huì)被廣泛應(yīng)用，為人類和動(dòng)物的臨床疾病的防治增添新的希望。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選的45味中藥中博落回、山楂、水楊梅、赤芍、黃柏、五味子、烏梅、黃連、馬齒莧和訶子10味中藥對大腸桿菌的抑制作用表現(xiàn)為高敏；八角茴香、柴胡、黃芩、荊芥、桔梗、石榴皮和山豆根7味中表現(xiàn)為中敏；其他28味中藥表現(xiàn)為不敏感。

本實(shí)驗(yàn)所篩選的45味中藥，抑菌效果最好的3味中藥依次為博落回、黃連和水楊梅，最小抑菌濃度依次為3.63、8.37、10.04 mg·mL-1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥對于不同動(dòng)物體內(nèi)分離到的致病性大腸桿菌的抑制作用差異不顯著。中藥對于大腸桿菌的抑制作用具有顯著的非特異性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥對多重耐藥菌株具有明顯的抑制效果，但是，中藥對于大腸桿菌的體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能說明該中藥對于疾病的治療效果。針對不同類型的大腸桿菌引起的疾病，仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)等進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為中藥在大腸桿菌病的治療研究上提供了重要的基礎(chǔ)依據(jù)。