張奇，劉英，胡海峰*，吳春珍，姜錦錦，李徹

1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040；2.國藥集團健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 201203

枳椇子為鼠李科植物枳椇HoveniaacerbaLindl.的成熟種子。中醫(yī)認為枳椇子具有解酒毒、護肝、止吐、利大小便的功效，枳椇子已有上千年的使用歷史，目前已被衛(wèi)生部藥品標準收載[1-2]。藥理研究表明，枳椇子具有抗腫瘤、降糖、降壓、利尿、抗脂質(zhì)過氧化等功效[3-5]。

嵇揚等[6]發(fā)現(xiàn)枳椇子水提物不僅可以抑制肝癌細胞株Bel-7402的增殖，通過動物實驗證明了枳椇子水提物在體內(nèi)具有一定的抑瘤效果。Ammar等[7]實驗表明枳椇子水提物可以有效降低白血病細胞系K562的氧化應(yīng)激水平并誘導(dǎo)細胞凋亡。眾多研究表明枳椇子可以有效調(diào)節(jié)慢性酒精性肝損傷模型大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝，并對酒精性肝損傷大鼠肝臟合成功能具有一定的保護作用[8-10]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FD8-3冷凍干燥設(shè)備(西盟生命科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；SE602F型電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；ZHJH-C11115B超凈工作臺(智誠設(shè)備有限公司)；Avanti J-26 XP離心機(貝克曼庫爾特有限公司)；Ti-s恒溫水浴鍋(尼康)。

1.2 材料

枳椇子購自亳州市常富藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為安徽亳州，經(jīng)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院吳春珍教授鑒定為鼠李科植物枳椇HoveniaacerbaLindl.的成熟種子。

300～400目硅膠、薄層色譜硅膠板(青島海洋化工有限公司)；乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合溶液(sigma公司)；腎癌細胞株OS-RC-2、結(jié)腸癌細胞株HCT-116、肝癌細胞株Huh-7、胰腺癌細胞株CFPAC-1(上海生命科學研究院)；小鼠肝癌細胞(H22，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評價中心)。

1.3 動物

SPF級ICR小鼠，培養(yǎng)于SPF級實驗動物環(huán)境，96只，雄性，體質(zhì)量19～21 g，許可證號：SCXK(滬)2013-0016。

2 方法及結(jié)果

2.1 提取

稱取經(jīng)干燥粉碎后的枳椇子粉末2.0 kg，60%乙醇水回流提取2次，經(jīng)石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取，得到枳椇子乙酸乙酯萃取物16.4 g。

2.2 枳椇子乙酸乙酯部位的分離純化

稱取10.0 g枳椇子乙酸乙酯樣品，加入少量甲醇攪拌溶解，將溶解后的甲醇溶液緩慢倒入10.0 g硅膠中，隨后將硅膠烘干為粉末狀。稱取150.0 g 300～400目硅膠裝入硅膠柱中，倒入拌有枳椇子乙酸乙酯樣品的硅膠干粉，壓實后用500.0 mL石油醚進行淋洗。淋洗完畢后進行梯度洗脫[石油醚-乙酸乙酯(10∶1～1∶10)，乙酸乙酯-甲醇(10∶1～1∶10)]，利用薄層色譜硅膠板判斷洗脫液組分，合并相同組分的洗脫液減壓濃縮[11]，最終得到12個組分(Ⅰ～Ⅻ)。

用少量DMSO溶解上述12個組分，加入培養(yǎng)基進行稀釋，制得含藥培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度分別為1000、100、10、1、0.1 μg·mL-1(DMSO低于0.5%)。將腎癌細胞株OS-RC-2、肝癌細胞株Huh-7復(fù)蘇并傳3代，使細胞達到適合的細胞密度。將細胞均勻鋪于96孔板，放置CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，使細胞充分貼壁。次日，吸出培養(yǎng)基，加入含藥培養(yǎng)基與含有相應(yīng)濃度DMSO的對照培養(yǎng)基，并設(shè)3復(fù)孔。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后加入10 μL/孔MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃孵育4 h，取出96孔板吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 min，使甲臢晶體充分溶解，測定波長為570 nm處的光吸收值并計算半數(shù)抑制率(IC50)。實驗結(jié)果見表1，結(jié)果標明枳椇子乙酸乙酯部位硅膠分離的第Ⅳ段具有較強的體外抗腫瘤活性。

表1 枳椇子乙酸乙酯部位硅膠分離各段對腫瘤細胞的增殖抑制作用 μg·mL-1

2.3 枳椇子抗腫瘤化合物活性篩選及結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 枳椇子抗腫瘤化合物活性篩選 使用制備級高效液相色譜儀將第Ⅳ段進行分離純化，流動相A泵為甲醇-0.1%甲酸水溶液(1∶9)，B泵為甲醇-0.1%甲酸(7∶3)。將出峰時間相同的成分接樣，合并，利用C18固相萃取柱進行脫磷酸處理后50 ℃旋蒸濃縮。得到4種白色結(jié)晶粉末ZJZ-Z1(126.0 mg)、ZJZ-Z2(1 968.1 mg)、ZJZ-Z3(72.2 mg)、ZJZ-Z4(31.8 mg)。

將上述4個化合物用DMSO溶解后加入培養(yǎng)基稀釋，質(zhì)量濃度為1000、100、10、1、0.1 μg·mL-1(DMSO低于0.5%)。將腎癌細胞株OS-RC-2、結(jié)腸癌細胞柱HCT-116、肝癌細胞株Huh-7、胰腺癌細胞株CFPAC-1復(fù)蘇并傳3代，使細胞達到適合的細胞密度。將細胞均勻鋪于96孔板，放置CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，使細胞充分貼壁。次日，吸出培養(yǎng)基，加入含藥培養(yǎng)基與含有相應(yīng)濃度DMSO的對照培養(yǎng)基，并設(shè)3復(fù)孔。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后加入10 μL/孔MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃孵育4 h，取出96孔板吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 min，使甲臢晶體充分溶解，測定波長為570.0 nm處的吸光度值并計算IC50。實驗結(jié)果見表2。

其中ZJZ-Z2對OS-RC-2、Huh-7、HCT-116、CFPAC-1的體外抑制活性較好，IC50分別為33.8、63.9、46.8、55.1 μg·mL-1。

2.3.2 枳椇子抗腫瘤化合物結(jié)構(gòu)鑒定 ZJZ-Z2為白色針狀晶體，易溶于乙酸乙酯、DMSO、甲醇、乙醇，難溶于石油醚、三氯甲烷。三氯化鐵反應(yīng)呈陽性，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，表明ZJZ-Z2可能為含有酚羥基的黃酮類化合物；Molish反應(yīng)呈陰性，表明化合物ZJZ-Z2中不含糖。

ZJZ-Z2紫外可見吸收光譜顯示的最大吸收波長為290.5 nm，ESI-MS正離子圖譜中出現(xiàn)m/z321.18的分子離子峰，提示ZJZ-Z2的分子量可能約為320。該化合物在13C-NMR(D2O，150 MHz)檢測中發(fā)現(xiàn)13個碳信號峰，其中δ147.28、δ108.13處的碳信號高度約為其他同類碳信號高度的2倍，推測ZJZ-Z2可能存在對稱結(jié)構(gòu)；DEPT90譜表明，該化合物含有5個次甲基信號(δ108.13、97.79、96.77、85.66、74.10)，+1H-NMR譜(D2O)含有6個信號峰。結(jié)合相關(guān)文獻對比分析[12-14]，ZJZ-Z2與二氫楊梅素(Dihydromyricetin)的物化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)基本一致，其分子式為C15H12O8，ZJZ-Z2與二氫楊梅素的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)對比見表3，結(jié)構(gòu)式見圖1。

表3 ZJZ-Z2的1H-NMR與13C-NMR數(shù)據(jù)

注：二氫楊梅素核磁測試溶劑為DMSO-d6，ZJZ-Z2核磁測試溶劑為D2O，由于溶劑效應(yīng)各信號峰位置出現(xiàn)少許偏差。圖1 ZJZ-Z2的化學結(jié)構(gòu)

2.4 ZJZ-Z2體內(nèi)抗腫瘤活性

2.4.1 小鼠瘤塊接種 用無血清的1640培養(yǎng)基將小鼠肝癌細胞株H22稀釋為1×107個/mL，抽取0.5 mL細胞懸液接種至ICR小鼠腹腔，9 d后從腹腔抽取瘤細胞腹水，1000 r·min-1離心，吸棄上清液，用0.9%氯化鈉溶液洗滌、離心兩次，加入0.9%氯化鈉溶液稀釋至密度為1.0×106個/mL。抽取0.2 mL細胞懸液，接入小鼠左腋下，建為H22小鼠腫瘤模型[6]。

(1)

表4 ZJZ-Z2對H22荷瘤小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量的影響

注：與正常組比，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表5 ZJZ-Z2對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響 %

如表4所示，ZJZ-Z2對H22荷瘤小鼠表現(xiàn)出較好的抑瘤效果，低、中、高3個劑量組對比，中、高劑量組的抑瘤率明顯高于低劑量組，中劑量組對腫瘤的抑瘤率略高于高劑量組。實驗結(jié)果表明順鉑與ZJZ-Z2對小鼠的體質(zhì)量產(chǎn)生一定影響；如表5所示，與模型組和正常組相比，給予ZJZ-Z2的各組肝臟指數(shù)明顯較小，表明ZJZ-Z2具有一定的肝毒性；高、中、低3個劑量組的脾臟指數(shù)隨著給藥劑量的上升呈下降趨勢，可能說明ZJZ-Z2具有一定的脾臟毒性，而高劑量組脾臟損傷相對于中劑量組較大，導(dǎo)致免疫機能受到抑制，這可能是高劑量組對H22小鼠腫瘤模型抑瘤效果不如中劑量組的原因之一。

3 討論

本研究通過60%乙醇提取和乙酸乙酯萃取的方式制備了枳椇子乙酸乙酯部位；使用300～400目硅膠將枳椇子乙酸乙酯部位分離富集為Ⅰ～Ⅻ段收集物，通過MTT法篩選發(fā)現(xiàn)其中第Ⅳ段具有最強的體外抗腫瘤活性，對各腫瘤細胞的IC50為200～400 μg·mL-1；使用制備液相色譜儀將該第Ⅳ段收集物進行分離富集得到4個化合物，分別為ZJZ-Z1、ZJZ-Z2、ZJZ-Z3、ZJZ-Z4，其中ZJZ-Z2具有最強的體外抗腫瘤活性；通過對ZJZ-Z2理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)的分析，并與相關(guān)文獻進行對比初步判定ZJZ-Z2為二氫楊梅素；通過H22荷瘤小鼠實驗，發(fā)現(xiàn)ZJZ-Z2對腫瘤組織表現(xiàn)出較強的抑瘤活性，其中ZJZ-Z2中劑量組的抑瘤率為81.35%。本研究首次發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可能是枳椇子乙酸乙酯部位中主要的抗腫瘤活性成分，此為枳椇子抗腫瘤藥物與產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。