王超　林松斌　許天獎(jiǎng)　尹毅銳

【摘要】 目的：研究乙型肝炎病毒（HBV）基因分型及其與原發(fā)性肝癌的關(guān)系。方法：回顧性收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2015年1月1日-12月31日符合入組條件的慢性乙型病毒性肝炎患者，按照是否合并肝癌分為肝癌組（182例）與非肝癌組（189例），通過留取血清來完善乙型肝炎病毒基因分型及相關(guān)耐藥性檢測(cè)。結(jié)果：371例乙肝患者，其中B型95例，C型患者276例;肝癌患者較非肝癌乙肝人群中HBV C型較B型所占比例顯著高（字2=6.366，P=0.012），肝癌患者中HBV C型較B型突變比率（耐藥性）顯著高（字2=6.777，P=0.009）。結(jié)論：相較乙肝人群中，HBV C型在乙肝相關(guān)的肝癌患者中占有更高的比例和突變率;相較B型也有更高的突變率;提示HBV C型突變型在肝癌發(fā)生中可能存在一定的作用。

【關(guān)鍵詞】 HBV基因分型; 原發(fā)性肝癌; 耐藥性

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.08.002 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2019）08-000-03

A Research on the Relationship between Hepatitis B Virus Genotyping and Primary Carcinoma of Liver/WANG Chao，LIN Songbin，XU Tianjiang，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（8）：-5

【Abstract】 Objective：To study the genotyping of hepatitis B virus（HBV） and its relationship with primary carcinoma of liver.Method：Retrospectively collected affiliated Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University on January 1，2015 and December 31，2015，complied with the conditions set of chronic hepatitis B patients with viral hepatitis，according to whether the merger of liver cancer divided into cancer group（182 cases） and non-cancer group（189 cases），through to return to improve serum hepatitis B virus genotyping and related drug resistance test.Result：There were 371 patients with hepatitis B，including 95 patients with type B and 276 patients with type C.The proportion of HBV type C in cancer patients was significantly higher than that of non-cancer patients

（字2=6.366，P=0.012），and the mutation（drug resistance） rate of HBV type C in cancer patients was significantly higher than that of type B （字2=6.777，P=0.009）.Conclusion：Compared with hepatitis B patients，HBV type C has a higher proportion and mutation rate in HBV-related liver cancer patients.It also has a higher mutation rate than type B.It suggests that HBV C type mutation may play a role in the occurrence of primary carcinoma of liver.

【Key words】 Hepatitis B virus gene type; Primary carcinoma of liver; Drug resistance

First-authors address：Xiamen Branch Zhongshan Hospital of Fudan University，Xiamen 361015，China

慢性乙型病毒型肝炎（HBV）是由乙型肝炎病毒所致的肝臟炎癥性疾病，歷經(jīng)1965-1979年國(guó)外相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)后正式予以命名，因其在全世界范圍流行，在中國(guó)更是病毒性肝炎的常見病因[1]。據(jù)調(diào)查，目前全世界大約20億人感染過HBV，最終有3.5億人發(fā)展為慢性乙型肝炎感染者[2]，而在這當(dāng)中中國(guó)則以60歲以下發(fā)病為主。HBV的基因型不同，不同基因型的臨床和病理特征也不同。原發(fā)性肝癌是中國(guó)常見惡性腫瘤死亡的第三大原因，嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的生命和健康。在這當(dāng)中以肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）多見，占85%～90%。在中國(guó)，HCC的發(fā)生率占世界的55%，約90%為乙肝肝炎相關(guān)的肝癌[3]。研究表明，長(zhǎng)期的慢性乙型病毒復(fù)制沒有控制，后期容易漸漸并發(fā)肝硬化甚至肝癌的發(fā)生。不同類型的HBV可能與HBV突變有關(guān)，因此本回顧性研究旨在探討HBV基因分型與原發(fā)性肝癌之間可能存在的關(guān)系，從而更好予以臨床指導(dǎo)和規(guī)范治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月1日-12月31日，于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院完善血清乙型肝炎病毒五項(xiàng)檢測(cè)的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病科和傳染病科的“慢性乙型肝炎防治指南”的修訂，診斷標(biāo)準(zhǔn)分類。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他肝臟相關(guān)病毒（甲型、丙型、丁型、戊型肝炎）的重疊感染;由脂肪、酒精、藥物、自身免疫等其他因素引起的各類肝臟損傷;合并原發(fā)性肝癌除外的其他惡性腫瘤病史。共有371例患者符合條件入組，按照是否合并肝癌分為肝癌組（182例）與非肝癌組（189例），通過留取血清來完善乙型肝炎病毒基因分型及相關(guān)耐藥性檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑

測(cè)定乙型肝炎病毒基因分型及相關(guān)耐藥性檢測(cè)儀器分別為Roche Light Cycler480熒光定量PCR儀，Roche公司生產(chǎn);ABI3130基因測(cè)序儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）生產(chǎn)。試劑盒是由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供（產(chǎn)品貨號(hào)：YZB/國(guó)0080-2009）。

1.3 方法

通過PCR擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光探針雜交技術(shù)對(duì)乙型肝炎病毒DNA進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)其產(chǎn)物通過測(cè)序分析來達(dá)到完成基因分型及耐藥突變點(diǎn)的檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0對(duì)肝癌組及非肝癌組所測(cè)的基因各分型及耐藥性結(jié)果進(jìn)行分析，率的比較采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

在符合入組條件的兩組人群371例中，男285例及女86例，平均年齡（49.95±13.65）歲。

2.2 分型情況

在肝癌組中182例中，乙肝基因分型B型36例，乙肝基因分型C型146例;在非肝癌組189例中，乙肝基因分型B型59例，乙肝基因分型C型130例。在肝癌組中182例中，乙肝基因野生型67例，乙肝基因突變型（耐藥型）115例;在非肝癌組189例中，乙肝基因野生型105例，乙肝基因突變型（耐藥型）84例。肝癌患者較非肝癌乙肝人群中HBV C型較B型所占比例顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.366，P=0.012），見表1。肝癌患者較非肝癌乙肝人群中HBV突變型（耐藥型）所占比例顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=13.097，P<0.001），見表2。

2.3 不同分型的耐藥性

HBV B型在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=1.889，P=0.169），見表3。

HBV C型在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=8.304，P=0.004），見表4。

在肝癌組患者中的HBV C型較B型突變比率（耐藥性）顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.777，P=0.009），見表5。

3 討論

慢性乙型病毒性肝炎是我國(guó)最常見的病毒性肝炎及肝功能異常的病因之一，新中國(guó)成立以來的廣泛流行及在人群中受累均受到國(guó)內(nèi)學(xué)者的關(guān)注;中國(guó)是HBV感染的高危地區(qū)，有近1億HBV攜帶者，其中20%～30%患有肝硬化和肝癌等嚴(yán)重疾病，且呈逐年遞增趨勢(shì)[5]。對(duì)HBV的研究中，歷經(jīng)1965-1979年國(guó)外相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)后正式予以命名，直至1988年國(guó)外學(xué)者才首次報(bào)道HBV基因分型，不同的毒株長(zhǎng)期與環(huán)境間的突變進(jìn)化，導(dǎo)致了A-H等8種分型[6-7]，近年來有文獻(xiàn)[8-9]顯示另有新的亞型I、J2型出現(xiàn)，但還存在著爭(zhēng)議。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，HBV基因型的分布存在種族和地理差異，A型更多地分布在歐洲和中非地域;亞洲的主要流行病型是B和C型;具體到中國(guó)的情況則是南部有多種B型，北部有C型，另外我國(guó)亦存在極少見的A型基因型存在[10]。不同基因型的流行病學(xué)和臨床特征也不同，與肝臟病變程度和藥物治療效果有一定的相關(guān)性[11]，影響著疾病的預(yù)后及病情的轉(zhuǎn)歸。在這項(xiàng)回顧性研究中，目前就診患者的基因型仍然主要是B和C。其中C型占優(yōu)勢(shì)，這一點(diǎn)與之前研究基本相仿，但因筆者所在醫(yī)院患者就診特殊性，具體南北或江浙一帶分型趨勢(shì)，無法較前比較造成了數(shù)據(jù)差異。

原發(fā)性肝癌也是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，在起病早期缺乏相關(guān)典型的臨床癥狀。其發(fā)病兇險(xiǎn)，中位生存期短，晚期治療效果欠佳為重要特征。而在我國(guó)更是高發(fā)，據(jù)文獻(xiàn)[12]統(tǒng)計(jì)，截至2016年，我國(guó)的原發(fā)性肝癌已占據(jù)全球的55%，發(fā)病率及死亡率繼續(xù)每年遞增，也是我國(guó)因腫瘤死亡的第三位，僅僅次于胃癌、肺癌[13]。原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)因素受多種因素、多因素和多種途徑的影響。然而，慢性病毒性肝炎，尤其是慢性乙型肝炎，在肝癌的發(fā)生中起重要作用。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家中，與原發(fā)性肝癌發(fā)生相關(guān)的肝炎，乙肝、丙肝均有，我國(guó)是乙肝大國(guó)，中國(guó)肝癌發(fā)病率高與慢性乙型肝炎的發(fā)病有很大關(guān)系。有研究報(bào)道乙型肝炎病毒載量和活躍復(fù)制與原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[14]。乙型肝炎病毒中的X蛋白直接激活原癌基因并使腫瘤抑制基因p53和p16失活。另一方面乙肝病毒復(fù)制活躍早期也通過損傷正常的肝細(xì)胞、炎癥進(jìn)展從而促進(jìn)肝臟腫瘤發(fā)生，特別是HBeAg也會(huì)幫助乙肝病毒避開免疫系統(tǒng)及作為靶抗原誘導(dǎo)免疫細(xì)胞攻擊被感染的肝細(xì)胞促進(jìn)這一過程;而乙肝病毒的耐藥和突變會(huì)通過調(diào)控pg RNA轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HBV基因組復(fù)制及加速腫瘤發(fā)生率[15]，本回顧性研究中的肝癌患者較非肝癌乙肝在人群中HBV突變型（耐藥型）所占比例顯著高（P<0.001），也恰好驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。雖然病毒突變對(duì)肝癌的發(fā)生存在作用，但是在本研究中，B型患者在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明了乙肝基因分型B型患者可能在其耐藥菌株的突變變異對(duì)肝臟腫瘤的發(fā)生無明顯作用，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)目前鮮見關(guān)于此方面的報(bào)道，亦有可能與個(gè)體差異及樣本量不大存在相關(guān)。乙型肝炎病毒基因分型C型患者，在本研究中，在肝癌患者較非肝癌乙肝人群比較中突變型（耐藥型）所占比例顯著高（P=0.004），且在肝癌人群中較B型的突變比率（耐藥性）也是顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明在乙型肝炎進(jìn)展為肝癌的過程中，C型基因的發(fā)病率較高。這點(diǎn)與國(guó)內(nèi)學(xué)者文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道研究是一致的。研究表明，B型患者較C型患者的HBeAg陽性低、血清轉(zhuǎn)換高，從而發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)低于C型基因[18]，這可能導(dǎo)致B和C基因型差異的存在，本文未做深一步地探討。近年來國(guó)內(nèi)學(xué)者司書梅等[19]的meta分析也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，且C型基因會(huì)較B型基因更容易引起耐藥突變及多基因點(diǎn)突變[20]，從而引發(fā)免疫逃逸最終增加腫瘤發(fā)生。

綜上所述，本研究總結(jié)了乙肝基因型與肝癌的相關(guān)性研究，相較乙肝人群中，HBV C型在乙肝相關(guān)的肝癌患者中占有更高的比例和突變率;相較B型也有更高的突變率;提示HBV C型突變型在肝癌發(fā)生中可能存在一定的作用，但仍需進(jìn)一步完善關(guān)于乙肝及肝癌的臨床資料，必要時(shí)擴(kuò)充病例數(shù)，并積極參與乙肝病毒全外顯子測(cè)序結(jié)果分析，進(jìn)一步發(fā)掘研究的不同方向;另一方面，乙肝病毒的耐藥性，特別是未用過核苷酸類似物藥物患者具有耐藥性及發(fā)生多重耐藥現(xiàn)象預(yù)示著乙肝基因耐藥性在肝病進(jìn)展研究中的重要性。研究還表明，積極有效抗病毒治療可以減輕病毒復(fù)制，減少對(duì)肝臟的損害，從而降低肝癌的發(fā)病率[21]，故臨床上可以根據(jù)乙肝基因分型及耐藥突變合理診斷及選擇合適抗病毒治療方案加以干預(yù)，從而降低肝癌及終末期肝病的發(fā)生率，為慢乙肝患者提供較好的預(yù)后。

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