張鈮璇 張璐瑤 曹艷楠 鄭桂恒 龍鴻

摘 ?要 ?由丹參四倍體和二倍體雜交獲得丹參三倍體，三倍體植株高度不育。為探討其育性的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，我們采用細(xì)胞學(xué)和解剖學(xué)的方法，對(duì)其花粉母細(xì)胞發(fā)育過程中的染色體和細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行了觀測。結(jié)果表明，丹參三倍體植株生長正常，在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中存在落后染色體、染色體不均等分向兩極、染色體橋等異?，F(xiàn)象，分裂結(jié)果產(chǎn)生三分體、微核等，而且花粉粒形態(tài)異常，產(chǎn)生畸變，萌發(fā)率極低。這些說明，丹參三倍體在生長發(fā)育過程中，由于減數(shù)分裂過程中染色體數(shù)目不平衡，在減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生各種畸變、異常的染色體和細(xì)胞的行為表現(xiàn)，是造成其不育的主要原因。本研究為丹參三倍體育性研究提供理論依據(jù)，也為丹參育種生產(chǎn)實(shí)踐提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 ?三倍體;育性;花粉母細(xì)胞;減數(shù)分裂;丹參

中圖分類號(hào) ?Q945.53 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?Triploid Salvia， with characters of sterility， was obtained through hybridization of diploid and tetraploid. In order to investigate the cytological mechanisms of its sterility， we observed the chromosome change and cell structure during the development of pollen mother cells. Results showed the triploid plants grew well. Numerous meiotic abnormalities， including lagging chromosomes， asymmetrical separation and chromosome bridges were found during the meiosis process. Micronuclei and triads were observed except tetrads. Moreover， the shape of the pollen was abnormal， and the pollen germination rate was very low. This indicated that the chromosomal and cytological abnormalities in the meiotic process due to chromosome number imbalance may lead to sterility in triploid Salvia. The data could provide experimental supports of fertility of triploid Salvia， and be useful in the breeding of the traditional Chinese medical herb.

Keywords ?triploid; fertility; pollen mother cell; meiosis; Salvia miltiorrhiza

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.013

唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）是中國傳統(tǒng)中藥的重要組成，丹參味苦，微寒，有活血祛瘀、痛經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，主要用于胸痹心痛、脘腹脅痛，心煩不眠、痛經(jīng)閉經(jīng)、瘡瘍腫痛等的治療[1]。丹參是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中應(yīng)用極為廣泛的中藥之一，在活血化瘀藥方面有著公認(rèn)的獨(dú)特療效，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、缺血性中風(fēng)等疾病[1]。近年來，以青蒿素研制獲得科學(xué)界最高獎(jiǎng)項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)為標(biāo)志，隨著歐美國家對(duì)中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的認(rèn)可度的逐步提高，以及大量丹參復(fù)方制劑的成分確定，中國藥典丹參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與歐盟、美國藥典比較接近，丹參在國際、國內(nèi)市場上的需求量越來越大[2]。野生丹參品種資源開發(fā)受限，丹參人工栽培后，各品種間的生物學(xué)性狀及生產(chǎn)力、抗病性、商品產(chǎn)量特性等分化明顯，生態(tài)適應(yīng)性、植株特征、花粉粒、染色體、同功酶和品質(zhì)特性均有顯著差別[3]，丹參新品種培育已經(jīng)得到較快發(fā)展[4]。

遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化是植物遺傳改良的主要方法。人工栽培丹參的新品種培育過程中，運(yùn)用這些技術(shù)手段，創(chuàng)造特異的新品種，是丹參新品種培育的重要途徑。丹參一般依靠營養(yǎng)繁殖，尤其以莖段扦插、分根為主，有些丹參不能進(jìn)行有性繁殖[4]。這些特點(diǎn)為丹參遠(yuǎn)緣雜交帶來一定困難。多倍化是高等植物進(jìn)化的重要力量，通過染色體加倍，基因重組，帶來新的變異，形成新的物種。研究表明，約有15%的被子植物在其物種形成過程中經(jīng)歷了多倍化[5]，超過70%的有花植物是多倍體[6]。多倍體植株具有營養(yǎng)器官體積大，營養(yǎng)成分增多，抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[7]，尤其在以收獲根莖葉營養(yǎng)器官為目的的中草藥種植中具有重要意義。

陳力等[8]采用未成熟的二倍體丹參種子，生長在1/2 MS+100 mg/L秋水仙堿的培養(yǎng)基中處理后，誘導(dǎo)四倍體并鑒定，再將四倍體丹參與二倍體丹參正、反交（4x♀×2x♂或2x♀×4x♂），結(jié)實(shí)率都很高，收獲種子播種后獲得三倍體。染色體倍性鑒定結(jié)果顯示，丹參染色體基數(shù)x為8，二倍體（2n=2x=16）、三倍體（2n=3x=24）、四倍體（2n=4x=32）。田間觀察發(fā)現(xiàn)，三倍體丹參地上部分（莖、葉）均比二倍體丹參對(duì)照增加1～1.5倍，地下部分（蘆頭、根）比二倍體丹參增加2倍以上。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，三倍體丹參在側(cè)根數(shù)目明顯增加，三倍體丹參主要活性成分測定顯示，樣品中的丹參酮IIA、丹酚酸B、丹參酮I、隱丹參酮等的含量均超過《中國藥典》規(guī)定的水平。

三倍體（3x）是倍數(shù)最低的多倍體，一般是由四倍體（4x）與二倍體（2x）雜交產(chǎn)生的，具有多倍體和雜交種產(chǎn)生的雙重優(yōu)勢，在藥用植物中具有巨大的生產(chǎn)潛力。從理論上講，三倍體高度不育[8]，只能依靠無性繁殖繼代。然而，生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)三倍體具有部分可育性，其育性機(jī)制不清。本研究以丹參三倍體為材料，通過解剖學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)的方法，分析了育性相關(guān)的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)，為闡明三倍體育性的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在丹參遠(yuǎn)緣雜交和多倍體育種生產(chǎn)實(shí)踐中具有一定的實(shí)用價(jià)值。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

丹參三倍體材料由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳力教授饋贈(zèng)，植物材料為三倍體組培苗，經(jīng)煉苗后移栽至天津農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田，常規(guī)大田管理，由于是組培苗移栽，在生長季植株陸續(xù)開花。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細(xì)胞學(xué)壓片 ?丹參三倍體花蕾生長早期，根據(jù)花蕾生長的長短不同進(jìn)行取材，經(jīng)卡諾氏固定液固定24 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中，4?℃條件下保存?zhèn)溆?。采用常?guī)壓片法進(jìn)行減數(shù)分裂染色體壓片，選取未成熟的花藥（長度在1～3 mm之間），用自來水浸泡、清洗20 min以上，然后用2.5%纖維素酶和2.5%果膠酶的混合酶液（2∶1）在28?℃對(duì)材料酶解30 min，水洗后用1 mol/L HCl 60?℃水解10 min，自來水沖洗3次，浸泡20 min，卡寶品紅染色10 min。Olympus BX53顯微鏡鏡檢，Spot Idea CCD相機(jī)拍照。

1.2.2 ?石蠟切片制作和解剖結(jié)構(gòu)觀察 ?以丹參三倍體不同發(fā)育時(shí)期的花藥為試材，用常規(guī)石蠟制片法將固定好的材料，分別進(jìn)行石蠟包埋、制片，顯微結(jié)構(gòu)觀察。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，愛氏蘇木精整染，Leica RM2265切片機(jī)切片，切片厚度8～10 μm，Leica DM 4000B顯微鏡鏡檢，觀察丹參三倍體不同發(fā)育時(shí)期的花藥解剖結(jié)構(gòu)，Leica DFC450 C相機(jī)拍照。

1.2.3 ?花粉顯微觀察和萌發(fā)試驗(yàn) ?參考張志良等[9]的方法;取即將開放的花朵，用鑷子夾出花藥使之鋪展在硫酸紙上陰干，待花粉自然散出后收集備用。離體萌發(fā)法采用培養(yǎng)基為0.1 g/L硼酸+10%蔗糖+0.5%瓊脂，倒入適量培養(yǎng)基于載玻片中央，待其稍凝固后用玻璃棒蘸取少量花粉均勻地抖落在上面，再放入濕培養(yǎng)皿中，保鮮膜封皿后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（252）℃，培養(yǎng)8?h后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。所有處理均重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)選擇10個(gè)視野計(jì)數(shù)。Leica DM 4000B顯微鏡鏡檢，Leica DFC450 C相機(jī)拍照。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?丹參三倍體植株及花器形態(tài)正常

為了解三倍體丹參植株的生長狀況，本研究對(duì)栽培丹參三倍體植株進(jìn)行了生長發(fā)育觀測。丹參三倍體植株生長健壯，從側(cè)根繁殖開始，營養(yǎng)生長期約3個(gè)月，植株莖葉繁茂，長勢旺盛，株高可達(dá)80?cm，進(jìn)入生殖生長后，植株正常開花，輪傘花序具多朵花，密集組成長及15?cm的頂生總狀花序，花冠藍(lán)紫色，唇形，2枚雄蕊形態(tài)正常，未出現(xiàn)失水、干癟等萎縮現(xiàn)象（圖1），說明三倍體植株經(jīng)營養(yǎng)生長后，能夠適時(shí)開花，雄蕊2枚正常狀，另外2枚退化不顯著;雌蕊2心皮，形態(tài)表現(xiàn)正常，但不收縮而分裂為4枚裂片。我們觀察了丹參二倍體的植株和花器官形態(tài)，與三倍體比較，無明顯差異。

2.2 ?丹參三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常

三倍體丹參的體細(xì)胞數(shù)為24條（2n=3x=24），在前期I觀察到三價(jià)體、二價(jià)體和單價(jià)體，構(gòu)型為2III+6II+6I（圖2A），在三倍體丹參的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期I，同源染色體彼此分開，分別向兩極移動(dòng)時(shí)，觀察到14個(gè)花粉母細(xì)胞出現(xiàn)落后染色體（圖2B），7個(gè)出現(xiàn)同源染色體分向不均等（圖2C），6個(gè)出現(xiàn)染色體橋（圖2D），分別占觀察總數(shù)124個(gè)花粉母細(xì)胞的比例為11.2%、5.6%和4.8%。

2.3 ?丹參三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂結(jié)果產(chǎn)生多分體異常

丹參三倍體在減數(shù)分裂后期Ⅱ，觀察到78.30%的細(xì)胞為四分體（圖3A），少量含有微核的異常四分體（圖3B）、三分體（圖3C）、二分體（圖3D）等特殊類型，說明對(duì)于丹參三倍體而言，大多數(shù)花粉母細(xì)胞能夠進(jìn)行正常減數(shù)分裂，一部分細(xì)胞不能形成四分體，減數(shù)分裂結(jié)果不正常，可能直接導(dǎo)致不育。

2.4 ?丹參三倍體花藥切片顯示花粉粒形態(tài)異常

花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生四分體，再發(fā)育形成單核花粉粒，進(jìn)而形成2或3細(xì)胞成熟花粉粒。石蠟切片結(jié)果顯示，丹參三倍體成熟花藥中花粉粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變異，與正常發(fā)育花藥中的花粉粒形態(tài)比較，這些花粉粒中的一部分呈橢圓形、邊緣規(guī)整，而另外一部分則形狀不規(guī)則，邊緣凹陷，產(chǎn)生畸形，呈敗育狀態(tài)（圖4）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，約54.5%的花粉粒為畸形花粉粒，約占花粉粒總數(shù)的一半。

2.5 ?丹參三倍體花粉萌發(fā)率極低

鑒于丹參三倍體花粉粒部分形態(tài)畸變，我們進(jìn)行了花粉萌發(fā)試驗(yàn)。由于無法區(qū)分在上述石蠟切片中觀察到的畸形花粉粒和正常形狀花粉粒，我們采集正常形狀的花藥，對(duì)其中的花粉粒進(jìn)行了萌發(fā)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參三倍體的花粉?；静幻劝l(fā)，極個(gè)別從萌發(fā)孔產(chǎn)生萌發(fā)跡象，但并不長出花粉管，其長度過小，無測量意義（圖5）。我們的花粉萌發(fā)試驗(yàn)沒有區(qū)分出畸形花粉粒，但結(jié)果是所有花粉粒均不萌發(fā)。

3 ?討論

天然加倍的多倍體植物在自然界中廣泛存在，并且在進(jìn)化歷程中逐漸完成二倍體化而成為新的物種。由于多倍體優(yōu)勢的存在，這些新物種具有自身的生長、發(fā)育、遺傳等優(yōu)勢，在自然競爭中擴(kuò)大了種群繁衍范圍，增強(qiáng)了適應(yīng)性，并被人類利用而得以延續(xù)下來[10]。獲得三倍體的途徑有三種：一是雌雄配子之一不減數(shù)，二者結(jié)合后產(chǎn)生;二是兩個(gè)精子同時(shí)進(jìn)入胚囊與卵細(xì)胞結(jié)合;三是用四倍體和二倍體雜交獲得[11]。三倍體丹參就是通過四倍體和二倍體雜交途徑獲得的，二倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂正常[8]。