劉珊廷 羅興錄 吳美艷 唐志平 王超超 張家陵

1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 ?530005;2. 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 ?530005

摘 ?要 ?本研究以木薯品種新選048為材料，利用高通量測序技術(shù)比較研究木薯連作與輪作的土壤微生物豐度、多樣性、群落組成，并結(jié)合土壤三相比和木薯產(chǎn)量綜合分析，探討木薯連作障礙與土壤微生物的關(guān)系。結(jié)果表明：木薯連作土壤的細菌豐度、多樣性高于輪作，連作細菌的OTU數(shù)目比輪作高23.05%，Chao1指數(shù)比輪作高463.2，香農(nóng)指數(shù)比輪作高0.41;而連作真菌豐度、多樣性低于輪作，輪作真菌的OTU數(shù)目比連作高19.57%，Chao1指數(shù)比連作高217.5，香農(nóng)指數(shù)比連作高0.76;連作土壤容重比輪作高0.24 g/cm3;土壤三相比，木薯連作的土壤固相比率比輪作高6.69%，液相比輪作高3.03%，而氣相比率比輪作減少9.72%，差異顯著（P<0.05）;輪作木薯產(chǎn)量比連作增產(chǎn)11.99 t/hm2，差異顯著（P<0.05）。由此可見，土壤微生物組和土壤三相比的變化與木薯連作障礙有密切關(guān)系，采取栽培管理措施調(diào)節(jié)土壤微物組成和土壤三相比，是克服木薯連作障礙的有效途徑。

關(guān)鍵詞 ?木薯;連作障礙;土壤微生物;高通量測序

中圖分類號 ?S533 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?The relationship between the continuous cropping obstacles of cassava and soil microorganisms was studied by a comprehensive analysis of the soil microbial abundance， diversity， and community composition， yield of cassava under continuous cropping and rotation using a cassava variety Xinxuan 048 as the material and using high-throughput sequencing technology in the experiment. The results showed that the bacterial abundance and diversity of cassava continuous soil were higher than that of the rotation. The number of OTUs of the bacteria for the continuous cropping was 23.05% higher than that of the rotation. The Chao1 index of the continuous cropping was 463.2 higher than that of the rotation and the Shannon index of the continuous croping was 0.41 higher than that of the rotation， while the abundance and diversity of the fungi of the continuous cropping were lower than that of the rotation. The number of OTUs of the fungi of the rotation was 19.57% higher than that of the continuous cropping， the Chao1 index of the fungi of the rotation was 217.5 higher than that of the continuous cropping， and the Shannon index of the rotation was 0.76 higher than that of the continuous crop. The soil bulk density of the continuous cropping was 0.24 g/cm3 higher than of the rotation. The soil solid phase in the continuous cropping was 6.69% higher than that in rotation， and the liquid phases was 3.03%， while gas phases was 9.72% lower than that in rotation. The yield of rotation was 11.99 t/hm2 higher than that of the continuous， reaching a significant level of 0.05. The changes of microbial community in the soil and the solid， liquid and gas phase of the soil were closely related to the continuous cropping obstacles of cassava. It is an effective way to overcome the continuous cropping obstacles of cassava to adopt cultivation management measures to adjust the composition of soil micro-organisms.

Keywords ?cassava （Manihot esculenta Crantz）; continuous cropping obstacles; soil microbiome; high-throughput

sequencing

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.002

木薯（Manihot esculenta Crantz）有“淀粉之王”之稱。不僅是優(yōu)質(zhì)淀粉作物，而且是重要生物質(zhì)能源作物[1-2]。以木薯為主要原料的生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)已列入國家重點發(fā)展產(chǎn)業(yè)之一[3-4]。然而，木薯是不耐連作的作物，連年種植不僅產(chǎn)量降低，而且品質(zhì)也下降。關(guān)于木薯連作障礙機理，近年來國內(nèi)外有不少研究。梁海波等[4]研究表明，木薯連作產(chǎn)量降低主要原因之一是連作土壤肥力下降。王戰(zhàn)[5]研究結(jié)果表明，木薯連作障礙與土壤磷營養(yǎng)有密切關(guān)系。周貴靖[6]研究結(jié)果表明，木薯連作障礙與土壤理化性狀惡化有關(guān)。近年來國內(nèi)外關(guān)于木薯連作障礙機理研究多數(shù)集中在土壤肥力和理化性狀，而對土壤微生物研究較少[7]。本研究主要從土壤微生物研究木薯連作障礙機理，探討木薯連作障礙與土壤微生物的關(guān)系，為克服木薯連作障礙提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試木薯品種為新選048，該品種是廣西大學(xué)木薯課題組育成，試驗在廣西南寧市興寧區(qū)五塘鎮(zhèn)廣西大學(xué)木薯種植基地進行。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗設(shè)計 ?試驗在廣西南寧市五塘鎮(zhèn)廣西大學(xué)木薯種植基地進行，試驗地土壤為沙壤土。試驗設(shè)計采用定位輪作與連作對比設(shè)置，木薯設(shè)輪作和連作2種處理，同一塊地一半輪作，另一半連作。輪作：2014年種植甘蔗，2015年種植甘薯，2016年種植玉米，2017年種植木薯。連作：2014—2017年連續(xù)4年種植木薯。重復(fù)3次，小區(qū)面積50 m2。

1.2.2 ?栽培管理 ?輪作和連作木薯都在2017年3月30日種植，行距與株距都為1 m。木薯種植前每公頃用N∶P2O5∶K2O為15∶15∶15的復(fù)合肥750 kg作基肥，種植后60 d施苗肥，其中尿素150 kg/hm2，氯化鉀150 kg/hm2，復(fù)合肥225 kg/hm2。種后120 d施薯肥，氯化鉀225 kg/hm2，復(fù)合肥225 kg/hm2。其他栽培管理與常規(guī)栽培相同。

1.2.3 ?土壤采樣 ?在木薯工藝成熟期每個小區(qū)隨機選取3株，在植株主莖周圍20 cm取0～10 cm土層的根際土壤，混勻在?80?℃保存供測定土壤微生物用。同時測定根際土壤三相比。

1.2.4 ?測定指標及方法 ?（1）土壤細菌豐度、多樣性，真菌豐度、多樣性測定采用高通量分析方法：樣品提取DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，細菌主要是基于16S區(qū)，真菌主要基于18S區(qū)或ITS區(qū)（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)），進行PCR擴增和產(chǎn)物純化、定量和均一化構(gòu)建文庫并進行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別（base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（sequenced reads）。

（2）土壤三相比測定采用環(huán)刀法。

（3）木薯主要經(jīng)濟性狀、塊根產(chǎn)量測定：在工藝成熟期每個小區(qū)隨機取5株考測單株塊根數(shù)、塊根長、塊根粗和塊根重。收獲小區(qū)鮮薯稱重，折算公頃產(chǎn)量。

（4）塊根淀粉含量測定：在工藝成熟期每個小區(qū)隨機取5株，每株取1條塊根切碎混勻后，采用國標酸解法測定塊根淀粉含量。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件、SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析，并采用Duncans法進行多重比較，顯著性水平為α=0.05。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?木薯輪作與連作土壤微生物

2.1.1 ?細菌、真菌豐度與多樣性 ?木薯輪作與連作的土壤細菌、真菌豐度與多樣性分析結(jié)果見表1。從表1可知，木薯連作土壤細菌OTUs數(shù)目及Chao1指數(shù)較輪作土壤高，差異顯著;而木薯連作土壤細菌Shannon指數(shù)值更大，Simpson指數(shù)值更小，連作土壤細菌的物種多樣性較輪作土壤高，差異不顯著[8]。說明木薯連作與輪作相比，土壤細菌豐度存在顯著性差異，細菌多樣性不存在顯著性差異。

從表1可以看出，連作土壤真菌OTUs數(shù)目及Chao1指數(shù)較輪作土壤低，差異達顯著水平（P<0.05）;木薯連作土壤真菌Shannon指數(shù)值更小，Simpson指數(shù)值更大，連作土壤真菌的物種多樣性較輪作土壤低，差異達顯著水平（P<0.05）。說明木薯連作與輪作相比，連作土壤真菌豐度與多樣性比輪作低[9-10]。

2.1.2 ?細菌群落組成 ?連作土壤樣品經(jīng)物種注釋后平均獲得39個門、104個綱、163個目、281個科和422個屬類細菌;輪作土壤樣品經(jīng)物種注釋后平均獲得32個門、89個綱、140個目、246個科和347個屬類細菌。細菌群落組成在門和屬水平見圖1。在門水平上，連作土壤樣品中，細菌優(yōu)勢菌落為變形菌（Proteobacteria，37.98%）、酸桿菌（Acidobacteria，22.23%）和綠彎菌（Chloroflexi，8.27%）;輪作土壤樣品中，細菌優(yōu)勢菌落為變形菌（Proteobacteria，41.83%）、酸桿菌（Acidobacteria，23.04%）和綠彎菌（Chloroflexi，9.03%）。在屬水平上，連作土壤樣品中，細菌優(yōu)勢菌落為酸桿菌（Acidobac teriaceae，6.78%）和黃色單胞菌（Xanthomo nadales，6.31%）;輪作土壤樣品中，細菌優(yōu)勢菌落為酸桿菌（Acidobacteriaceae，8.31%）和黃色單胞菌（Xanthomonadales，8.35%），與周嵐等[11]的研究結(jié)果相似。

從輪作與連作木薯根際土壤細菌群落組成分析結(jié)果可知，連作木薯根際土壤細菌群落中的種群數(shù)量比輪作明顯增多，這表明木薯連作會引起土壤微生物結(jié)構(gòu)改變而抑制木薯塊根生長發(fā)育而導(dǎo)致減產(chǎn)。致于土壤微生物結(jié)構(gòu)改變抑制木薯塊根生長發(fā)育的機理有待進一步研究。

2.1.3 ?真菌群落組成 ?連作土壤樣品經(jīng)物種注釋后平均獲得10個門、22個綱、49個目、80個科和102個屬類真菌;輪作土壤樣品經(jīng)物種注釋后平均獲得10個門、26個綱、55個目、101個科和134個屬類真菌。真菌群落組成在門和屬水平

C：連作;R：輪作。

如圖2所示。在門水平上，連作土壤樣品中，真菌優(yōu)勢菌落為子囊菌（Ascomycota，49.59%）、擔子菌（Basidiomycota，11.82%）和被孢霉（Morti erellomycota，5.79%）;輪作土壤樣品中，真菌優(yōu)勢菌落為子囊菌（Ascomycota，41.70%）、擔子菌（Basidiomycota，10.13%）和被孢霉（Mortier ellomycota，6.47%）。在屬水平上，連作土壤樣品中，真菌優(yōu)勢菌落為被孢霉（Mortierella，5.65%）、孢子菌（Codinaea，3.91%）和隱球菌（Saitozyma 1.52%）;輪作土壤樣品中，真菌優(yōu)勢菌落為被孢霉（Mortierella，6.36%）、隱球菌（Saitozyma， 3.24%）和球腔菌（Mycosphaerella，2.26%）。

從輪作與連作木薯根際土壤真菌群落組成分析結(jié)果可知，連作木薯根際土壤真菌群落中的種群數(shù)量比輪作明顯減少，這表明木薯連作抑制了根際土壤某些真菌種群的生長和繁殖。木薯連作塊根生長不良而減產(chǎn)是否與根際土壤真菌種群減少有關(guān)，其作用機制如何？這個問題有待進一步研究。

2.2 ?木薯輪作與連作土壤物理性狀

2.2.1 ?木薯輪作與連作土壤容重 ?木薯輪作與連作土壤容重測定結(jié)果見表2。從表2可以看出，木薯輪作土壤容重明顯低于連作，差異達顯著水平（P<0.05）。由此可見，木薯輪作可以降低土壤容重。土壤容重降低，土壤緊實度變小，有利木薯塊根生長發(fā)育和淀粉積累。

2.2.2 ?木薯輪作與連作土壤三相比 ?土壤固相、液相和氣相體積比是反映土壤通氣性、保水性的重要指標。木薯輪作與連作的土壤固相、液相和氣相體積測定結(jié)果見表3。由表3可知，木薯輪作土壤的固相和液相比連作的低，而土壤的氣相比連作高。可見，輪作可以提高土壤的通透性。木薯是塊根作物，土壤通透性提高對促進塊根的生長發(fā)育和淀粉積累起重要作用。

木薯輪作與連作的主要經(jīng)濟性狀、塊根產(chǎn)量的考測與測定見表4。從表4可知，木薯輪作與連作單株塊數(shù)、塊根粗、塊根長、單株塊根重、產(chǎn)量輪作顯著高于連作。這表明木薯連作減產(chǎn)主要是連作使塊根生長發(fā)育受到抑制。至于其機理有待進一步研究。

3 ?討論

土壤微生物對土壤肥力和作物生長有明顯影響。許多研究表明土壤細菌能分解有機質(zhì)為植物提供有效養(yǎng)分來源，對促進土壤有機物質(zhì)分解、營養(yǎng)傳遞和能量流動，促進作物生長起重要作 ?用[12-14];土壤真菌能降解復(fù)雜化合物，與作物共生形成菌根，對促進作物生長，維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用[15]。徐海強等[16]對木薯與花生間作的土壤微生物組研究發(fā)現(xiàn)，間作可促進土壤微生物活動，改善土壤細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，促進土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，促進木薯、花生生長，提高木薯、花生產(chǎn)量。本研究結(jié)果表明，木薯輪作與連作對土壤微生物組的影響有明顯差異。輪作可促進土壤真菌種群尤其是好氣性種群繁殖，促進養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，同時真菌與木薯根共生形成菌根，增強木薯對養(yǎng)分吸收，促進木薯生長，提高木薯產(chǎn)量。連作促進細菌種群尤其是厭氧種群繁殖，抑制養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和吸收，導(dǎo)致木薯塊根發(fā)育不良，產(chǎn)量下降。

土壤真菌與土壤養(yǎng)分有效化有密切關(guān)系，土壤微生物中有許多真菌種群參與土壤有機質(zhì)礦化分解，促進土壤養(yǎng)分有效化，提高土壤有效養(yǎng)分含量[15]。而參與土壤有機質(zhì)礦化分解的真菌大多是好氣性種群，土壤通氣性良好可促進好氣性微生物活動，從而促進土壤養(yǎng)分有效化。反之，土壤通氣不良則抑制土壤好氣性微生物活動，影響土壤養(yǎng)分有效化[17]。本研究結(jié)果表明，連作木薯土壤容重顯著高于輪作木薯，土壤三相比中連作木薯的氣相比率比輪作顯著降低，根際土壤真菌種群數(shù)量比輪作木薯顯著減少，這表明，木薯連作由于土壤通氣不良，抑制了促進土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的真菌種群的生長和繁殖，從而影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，使土壤有效養(yǎng)分含量下降，影響木薯生長而導(dǎo)致減產(chǎn)。這與周貴靖等[6]研究發(fā)現(xiàn)，連作木薯根際土壤速效氮、磷、鉀的含量比輪作木薯明顯降低的結(jié)果一致。與孟品品等[18]研究馬鈴薯連作的結(jié)果相似。

土壤細菌是與作物土傳病害密切相關(guān)的一種微生物[19]。木薯連作根際土壤微生物群落中細菌的種群尤其是厭氧菌種群數(shù)量比輪作明顯增多，這可能是木薯連作使土壤理化性狀惡化，通透性差，導(dǎo)致厭氧細菌種群繁殖和積累，而厭氧細菌種群尤其是有害的厭氧細菌種群繁殖和積累，會抑制木薯塊根生長發(fā)育，導(dǎo)致木薯塊根生長發(fā)育不良，從而使木薯塊根減少，塊根變短變小，產(chǎn)量大幅度下降。此外，厭氧細菌種群的繁殖和積累可能抑制土壤養(yǎng)分有效化，從而影響木薯對養(yǎng)分的吸收利用，導(dǎo)致木薯生長不良而減產(chǎn)[20]。致于厭氧細菌種群的繁殖和積累抑制木薯塊根生長發(fā)育的生理、分子機制有待進一步研究。

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