燕麗萍，吳德軍，毛秀紅，姚俊修，任 飛，李善文，王開芳，王因花，劉翠蘭

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟南 250014；2.山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟南 250014）

白蠟屬Fraxinus隸屬木犀科Oleceae 木樨亞科[1]。白蠟屬植物全世界約70余種，我國有30多種，品種繁多，種質(zhì)資源非常豐富[2-3]。據(jù)崔鐵成報道，西安植物園收集保存了陜西白蠟樹屬植物資源標(biāo)本300 余號，共10 個種[4]。據(jù)國家林木種質(zhì)資源平臺統(tǒng)計，中國林科院林研所、黑龍江林業(yè)科學(xué)研究院等單位在黑龍江省林口青山水曲柳保存庫共保存水曲柳家系428份，遼寧省本溪市恒仁縣保護區(qū)水曲柳種子園共收集保存野生資源（群體）130份左右，遼寧省鞍山市岫巖縣清涼山林場收集保存水曲柳無性系70 個左右。湖北省林木種苗管理總站收集選育了湖北白蠟無性系10 余個，其他單位也相繼收集保存了美國白蠟、小葉白蠟等樹種的種質(zhì)資源。山東省林業(yè)科學(xué)研究院歷經(jīng)30 余年的調(diào)查，收集保存絨毛白蠟等種質(zhì)資源300 余份，建立了國家白蠟良種基地。這些寶貴的種質(zhì)資源為白蠟屬植物遺傳改良和創(chuàng)新利用提供了大量的資料，豐富的種質(zhì)資源使育種目標(biāo)更具有可行性和可靠性，然而龐大的種質(zhì)資源數(shù)量又給保存及評價鑒定帶來了困難[5]。因此，構(gòu)建核心種質(zhì)，充分利用現(xiàn)有白蠟種質(zhì)資源遺傳多樣性就顯得十分重要。

Frankel 首次提出核心種質(zhì)這一概念[6]，核心種質(zhì)是以最小樣本種質(zhì)資源的數(shù)量能夠最大程度地代表整個種質(zhì)資源樣本的遺傳多樣性，繼續(xù)深入的挖掘優(yōu)異基因核心資源，能夠有效提高種質(zhì)資源的利用價值和效率。近年來構(gòu)建核心種質(zhì)已成為林木種質(zhì)資源國際研究的熱點[7-8]，自從1994年國際上提出構(gòu)建核心種質(zhì)，已經(jīng)在很多農(nóng)作物上構(gòu)建了核心種質(zhì)，如小麥Triticum aestivum[9]、蠶豆Vicia faba[10]、水稻Oryza sativa[11]和扁豆Lablab purpureus[12]。而林木核心種質(zhì)僅對木荷Schima superba[13]、楸樹Catalpa bungei[14]、銀杏Ginkgo biloba[15]和歐洲黑楊Populus nigra[16]等樹種進行了初步研究。林木大多數(shù)為多年生木本植物，保存方式主要以原地保存和異地保存為主，占地面積大，管理經(jīng)費高，建立林木核心種質(zhì)是十分必要和迫切的。核心種質(zhì)的構(gòu)建為種質(zhì)資源的有效保護和深入評價開辟了新途徑。本課題選用SSR標(biāo)記對我國不同地區(qū)的白蠟資源進行遺傳多樣性研究，目的在于對白蠟屬植物核心種質(zhì)進行構(gòu)建，并初步驗證核心種質(zhì)資源的代表性，為白蠟種質(zhì)資源的收集、保存和核心材料的有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2013年在甘肅、陜西、新疆等8個省市自治區(qū)收集的資源，于2014年春天嫁接保存山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗站（37°16′N，118°58′E，面 積 為180 hm2，年均氣溫13.2 ℃，年均降水量708.4 mm）。取樣種質(zhì)為山東12 個地區(qū)（158份） 、北京（16份） 、陜西4 個地區(qū)（15份） 、新疆（6份）、甘肅（3份）、湖南（2份）、河北（1份）和黑龍江（1份）8 個?。ㄊ校?22 個地區(qū)的202份白蠟種質(zhì)資源，包括14 個種，其中絨毛白蠟Fraxinus velutina96份，中國白蠟Fraxinus chinensis25份，花曲柳Fraxinus rhynchophylla20份，美國紅梣Fraxinus pennsylvanica18份，歐洲白蠟Fraxinus excelsior11份，美國白蠟Fraxinus americana8份，窄葉白 蠟Fraxinus baroniana4份，秦嶺梣Fraxinus platypoda4份，新疆小葉白蠟Fraxinus sogdiana3份，象蠟樹Fraxinus platypoda3份，水曲柳Fraxinus mandschurica3份，狹葉白蠟Fraxinus angustifolia3份，對節(jié)白蠟Fraxinus hupehensis3份，廬山白蠟Fraxinus sieboldiana1份（表1）。于2016年8月取生長健壯、無病蟲害的單株新鮮幼葉2～3 個，液氮速凍帶回實驗室，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 的提取

基因組DNA 提取采用CTAB 法，提取緩沖液中加入2%β-巰基乙醇和2%PVP，并稍做改進[17]。紫外分光光度法測定DNA 的濃度和純度，稀釋至30 ng·μL-1，保存-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 SSR 引物篩選和PCR 擴增

選取表型性狀差異較大的4 個白蠟品種華雄、魯蠟5 號、金葉白蠟和金枝白蠟提取DNA 進行SSR 引物篩選，所用引物課題組通過轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)獲得，初步篩選500 對SSR 引物作為本研究的候選引物，由山東沃恩科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系：引物正反向引物各0.3 μL（10 μmol·L-1）、DNA 模板0.2 μL-1、PCR-Mix 5.5 μL、ddH2O 3.7 μL共計10 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，54～58 ℃退火1 min，72 ℃延伸l min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃10 min 終止反應(yīng)。SSR 擴增產(chǎn)物在8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測，擴增產(chǎn)物點樣3.5 μL，分子量標(biāo)準(zhǔn)為50 bp DNA Ladder，在200 V 電壓下預(yù)電泳30 min，再繼續(xù)電泳2 h，用0.1%的AgNO3溶液銀染，漂洗，NaOH 溶液顯色，凝膠掃描保存，統(tǒng)計數(shù)據(jù)后進行分析，具體步驟參考趙梁軍等的專利技術(shù)（ZL 201410318921.X,2015.9）[18]。最終從500 對引物中篩選出擴增帶型清晰、主帶明顯、穩(wěn)定、多態(tài)性、重復(fù)性好的42對高效SSR 引物標(biāo)記。

表1 白蠟種質(zhì)資源Table1 Fraxinus germplasm resources

續(xù)表1Continuation of table 1

1.2.3 SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

從42 對引物中篩選出多態(tài)性好的17 對引物（表1），在每對引物5′端添加熒光標(biāo)記FAM（6-carboxy-fluorescein）。正向引物為與攜帶熒光標(biāo)記的TP-M13 引物組成，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳的PCR擴增采用10 μL 的反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL-1、2X Taq plus PCR Master Mix 5 μL、正反向引物各0.1 μL（10 μmol·L-1）以及 ddH2O 共10 μL。PCR 擴增程序采用Touchdown 模式：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s（每個循環(huán)降低0.5℃），72℃延伸30 s ，15 個循環(huán)；95 ℃變性30 s ，50 ℃退火30 s ，72 ℃延伸30 s，20 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物0.3 μL、GS-500LIZ 分子量內(nèi)標(biāo)0.5 μL 和去離子甲酰胺9.5 μL 混合加入PCR 板，95℃變性5 min，4 ℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機檢測。采用3730 xl DNA 測序儀進行毛細(xì)管電泳：預(yù)電泳15 kV 下3 min；1.6 kV 下進樣15 s；電泳15 kV下20 min。將上機結(jié)果原始文件導(dǎo)入Genemarker 2.2.0 軟件，進行數(shù)據(jù)收集和圖像分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)篩選引物時確定的分子量大小及引物顏色進行分子量的確定，將收集的原始數(shù)據(jù)采用Data Collection 軟件導(dǎo)入Gene Marker 2.2.0 系統(tǒng)進行分析[19]。根據(jù)目標(biāo)峰值大小系統(tǒng)軟件與其泳道中的GS-500LIZ 分子量內(nèi)標(biāo)進行比較，準(zhǔn)確計算出目標(biāo)DNA 片段大小，將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)化成PDF圖片格式導(dǎo)出。各熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測3 次重復(fù)，3 次重復(fù)的平均值作為實驗材料在該座位上的數(shù)據(jù)。

1.2.5 核心種質(zhì)構(gòu)建

基于SSR 多樣性計算的期望雜合度，根據(jù)每個白蠟樣品對總體遺傳多樣性的貢獻程度，對所有白蠟樣品進行了排序。具體方法通過R 語言包Genetic Subsetter 實現(xiàn)[20]，該算法已被成功用于美國農(nóng)業(yè)部大麥核心種質(zhì)的構(gòu)建。樣本數(shù)量占總數(shù)量的20%和40%，分別構(gòu)成核心種質(zhì)的樣本群。核心種質(zhì)和初始種質(zhì)資源的有效等位基因數(shù)、Shannon’s 多樣性信息指數(shù)、遺傳多樣性等指標(biāo)進行t檢驗，評價核心種質(zhì)代表性的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標(biāo)記SSR 多態(tài)性引物篩選

利用8%非變性聚丙烯酰胺凝上電泳初步篩選出的42 對多態(tài)性引物（圖1），采用42 對引物對4 個白蠟品種進行熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的部分引物，添加熒光標(biāo)記后采用毛細(xì)管電泳方法檢測不到穩(wěn)定的片段，因此根據(jù)熒光PCR 檢測排除較多峰型異常和位點不易辨別的引物（圖2），最終篩選出分辨率高、穩(wěn)定性高和多態(tài)性高的17 對引物（表2）。

2.2 202份白蠟屬種質(zhì)SSR 遺傳多樣性分析

圖1 引物147 在46份白蠟中的擴增結(jié)果Fig.1 DNA fragments amplified by SSR primer 147 in 46 Fraxinus

圖2 引物202 在不同白蠟品種間擴增產(chǎn)物的帶型Fig.2 Amplification bands between different genotypes of Fraxinus using primer 202

表2 17對SSR熒光引物信息Table2 Information of 17 SSR fluorescence primer pairs

表3結(jié)果可見，17 對SSR 引物擴增共檢測出142 個等位基因（Na），不同引物擴增可檢測到有效等位基因數(shù)為2（S217）～15（S203）個，每對引物的等位基因數(shù)明顯不同，平均每對引物等位基因數(shù)為8.353 個；有效等位基因（Ne）數(shù)范圍為1.503（S112）～5.260（S202）個，平均每對引物3.342 個。PIC 變動范圍為0.315（S112）～0.783（S202），平均0.635，表明白蠟品種間變異較大，具有豐富的遺傳多樣性。Shannon 指數(shù)變化范圍為0.705（S112）～1.877（S202），均值為1.393；觀測雜合度Ho指數(shù)變化范圍為0.168（S208）～0.980（S123），平均為0.557；期望雜合度He指數(shù)變化范圍為0.335（S112）～0.810（S202），平均為0.677。綜上所述，可得出S202、S203、S186 這3 對引物是17 對引物中鑒定效率最高的引物，今后在白蠟DNA 指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及品種鑒定中重點應(yīng)用。

表3 白蠟202份種質(zhì)資源遺傳多樣性分析Table3 The genetic diversity parameters of Fraxinus germplasm resources

2.3 核心種質(zhì)的構(gòu)建與評價

通過R 語言包Genetic Subsetter 對白蠟樣品的排序結(jié)果，按照原始種質(zhì)構(gòu)建了20%候選核心種質(zhì)。由表4可知，通過對遺傳多樣性指數(shù)的分析，并與原始種質(zhì)比較顯示，原始樣本和初步構(gòu)建的核心種質(zhì)樣本遺傳特性極其相近。遺傳多樣性的保留率等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、觀測雜合度Ho、Shannon 信息指數(shù)I、期望雜合度He及多態(tài)信息指數(shù)PIC 分別為180.3%、106.2%、107.0%、107.8%、105.6%和101.7%。

利用SAS 軟件對構(gòu)建的不同核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)進行t檢驗，表4結(jié)果顯示各遺傳多樣性參數(shù)與原始種質(zhì)差異不顯著，因此選擇樣品數(shù)量最少的20%為核心種質(zhì)，即40份種質(zhì)編號（與表1一致）分別為2、7、13、15、16、18、25、41、42、43、50、51、54、55、56、58、60、61、63、64、73、74、77、84、87、95、105、116、124、141、146、147、156、159、164、175、176、191、193 和197。表明構(gòu)建的核心種質(zhì)進行了有效的選取，能夠很好的保存了原始種質(zhì)資源的遺傳多樣性，又可以利用最少的白蠟核心種質(zhì)能夠充分代表原始種質(zhì)資源最大的遺傳多樣性。

表4 供試白蠟種質(zhì)的初級核心樣品及核心種質(zhì)的遺傳多樣性比較Table4 Comparisons of genetic diversity of the primary core samples and core collection of Fraxinus cultivars

黑龍江、北京、湖南長沙及新疆烏魯木齊4個地區(qū)的核心種質(zhì)資源數(shù)分別占該地區(qū)原始種質(zhì)資源數(shù)的100%、56.3%、50% 及50%，均遠(yuǎn)高于20%，說明這4 個地區(qū)的白蠟資源遺傳多樣性的豐富度遠(yuǎn)高于原始種質(zhì)（表5）。反之也可以說明，甘肅天水、河北石家莊、山東菏澤、山東濟寧、山東臨沂和陜西楊凌6 個地區(qū)的遺傳多樣性很低。

表5 各地區(qū)的核心種質(zhì)數(shù)及其占該地區(qū)原始種質(zhì)數(shù)的比例Table5 Ratios of core collection from each original germplasms

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

3.1.1 白蠟種質(zhì)遺傳多樣性

解決育種和種質(zhì)資源管理方面的問題，研究其物種的遺傳多樣性和種質(zhì)間的親緣關(guān)系具有非常重要的意義[21-23]。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SSR 技術(shù)對白蠟種質(zhì)SSR 反應(yīng)體系優(yōu)化和遺傳多樣性前人已有研究報道，平均每對引物能檢測到3.5 個多態(tài)位點，多態(tài)性信息含量（PIC）平均為0.548 0[24-25]，但是使用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測SSR 標(biāo)記的方法，構(gòu)建白蠟屬植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析還鮮見報道。本研究遴選了17 對引物對202份白蠟屬植物種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，所有引物均表現(xiàn)出較好的多態(tài)性，這一結(jié)果高于前人的研究結(jié)果。本研究中有效等位基因（Ne）數(shù)范圍為1.503（S112）～5.260（S202）個，平均每對引物3.342 個。PIC 變動范圍為0.315（S112）～0.783（S202），平均0.635，表明白蠟品種間變異較大，具有豐富的遺傳多樣性，這也說明熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測SSR 標(biāo)記技術(shù)非常適用于白蠟親緣關(guān)系的研究。

3.1.2 白蠟核心種質(zhì)的構(gòu)建

前人主要采用形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記2 類方法構(gòu)建核心種質(zhì)[26]。利用分子標(biāo)記來構(gòu)建核心種質(zhì)是準(zhǔn)確而有效的方法，這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多種質(zhì)資源的研究中[27-28]。衡量構(gòu)建核心種質(zhì)的重要因子是樣本量的大小和取樣方法，核心種質(zhì)代表整個遺傳資源的最大的遺傳多樣性[29]。核心種質(zhì)取樣比例應(yīng)根據(jù)不同物種特性的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)而定[30]。因此，本研究利用17 對多態(tài)性SSR 引物，根據(jù)白蠟樣品對總體遺傳多樣性的貢獻程度，進行了排序，構(gòu)建白蠟屬植物的核心種質(zhì)，該研究方法已在許多研究中報到[31-32]。

從目前發(fā)表的相關(guān)文獻可以看出，國內(nèi)外研究中所構(gòu)建的不同植物核心種質(zhì)其所占比例大多數(shù)在5%～40%[33-34]。Liang 等利用SSR 標(biāo)記獲得了55份蘋果Malus domestica核心種質(zhì)，占分析種質(zhì)的13.2%[35]。王萱等分析了180份銀杏Ginkgo biloba古樹的遺傳多樣性，獲得了63份核心種質(zhì)占35%[36]。這些結(jié)果均表明取樣比例的大小應(yīng)視種質(zhì)資源的種群數(shù)量和遺傳多樣性來確定。在本研究中，在原始202份白蠟種質(zhì)的基礎(chǔ)上，逐步構(gòu)建了60%、40%和20%不同比例的核心種質(zhì)，通過3 種不同取樣的方式比較白蠟屬植物的核心種質(zhì)，最終選取20%的比例作為構(gòu)建的核心種質(zhì)，能夠很好地代表整個白蠟屬植物資源的遺傳變異。選出的40份核心種質(zhì)涵蓋了來自中國22 個省（區(qū)），表3結(jié)果發(fā)現(xiàn)各遺傳參數(shù)與原始種質(zhì)差異不顯著，因此，所構(gòu)建的核心種質(zhì)能夠充分代表原始種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

3.2 結(jié) 論

本研究從42 對SSR 引物中篩選出17 對擴增穩(wěn)定的熒光標(biāo)記引物，采用毛細(xì)管法研究了來自全國22 個地區(qū)的具有代表性的202份白蠟種質(zhì)資源的遺傳多樣性，共檢測出142 個等位變異，平均每對引物等位基因（Na）數(shù)為8.353 個；平均有效等位基因數(shù)（Ne）為3.342；平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.635 2，白蠟屬植物種間變異較大，具有豐富的遺傳多樣性，建立基于高通量熒光SSR標(biāo)記的白蠟種質(zhì)鑒定體系。并首次構(gòu)建了白蠟屬植物的40份核心種質(zhì)，對白蠟屬植物種質(zhì)資源的保護、管理和利用提供了理論依據(jù)和種質(zhì)材料。