孫紅英，辛全偉，林興生，羅海凌，林 輝，馬志慧，嚴(yán)少娟，c，蘭思仁

（福建農(nóng)林大學(xué) a.林學(xué)院；b.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心；c.資源與環(huán)境學(xué)院，福建 福州 350002）

日本紅楓青龍羽毛楓Acer palmatum‘seiryu’是1965年由荷蘭鹿特丹Trompenburg 樹(shù)木園的J.R.Pn Hoey Smith 培育的新品種，在歐美大量運(yùn)用。該品種于1984年得到英國(guó)皇家園藝協(xié)會(huì)“提名榮譽(yù)”獎(jiǎng)，被歐美園藝界公論為近幾十年來(lái)杰出的新品種。青龍羽毛楓為落葉小喬木，高可達(dá)8 m，此品種雖然有著秀麗的葉形，屬于羽毛楓類(lèi)，但莖桿直立、不下垂。葉色春季嫩綠，夏季亮綠，秋季轉(zhuǎn)為鮮艷的紅銅色，夏季偶有焦葉現(xiàn)象，葉掌深裂幾達(dá)基部，為7～11 深裂，裂片狹長(zhǎng)又有羽狀細(xì)裂，具細(xì)葉齒。生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，速度快，樹(shù)姿優(yōu)美，無(wú)論是孤植、群植還是作為行道樹(shù)種植，能以“紅袖善舞翠云間”的火熱魅力，讓人們陶醉其中，怡然自得，是優(yōu)秀的園林觀葉植物新品種。若以常綠樹(shù)或白色墻體為背景，景觀尤為美麗。

青龍繁殖較為困難，扦插成活率低。目前，青龍繁殖以嫁接為主，但由于砧木與接穗的親和關(guān)系，嫁接成活率不理想[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)植物組培快繁技術(shù)，建立起青龍組培快繁體系，成活率達(dá)到90%以上，為工廠化育苗提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料取自福清市馬洋亭下花木種植農(nóng)民專(zhuān)業(yè)合作社，選取健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、當(dāng)年半木質(zhì)化的枝條。將枝條切除葉片和葉柄后，在自來(lái)水下沖洗干凈，然后在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分，用75%酒精消毒40 s，無(wú)菌水沖洗3 遍，接著用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖5 遍，用無(wú)菌濾紙吸干水分，待用。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基為木本專(zhuān)用培養(yǎng)基WPM，pH 值調(diào)整至5.8，添加瓊脂6.5 g/L，蔗糖30 g/L。光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度50～70 mol/m2s，培養(yǎng)溫度25～28 ℃，環(huán)境濕度60%～70%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青龍啟動(dòng)培養(yǎng)

采用以下6 種培養(yǎng)基進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)：1）WPM+ 0.01 mg/L TDZ；2）WPM + 0.03 mg/L TDZ；3）WPM+0.05 mg/L TDZ；4）WPM+0.07 mg/L TDZ；5）WPM+0.09 mg/L TDZ。以上各培養(yǎng)基均添加30 g/L 蔗糖和6.5 g/L 瓊脂，pH 值5.8。每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理30瓶，重復(fù)3次。30 d后，觀察腋芽的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)啟動(dòng)率。

1.3.2 青龍的繼代培養(yǎng)

采用L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，TDZ 為3 個(gè)水平：0.04、0.06、0.08 mg/L。生長(zhǎng)素IBA 3 個(gè)濃度梯度為：0.1、0.3、0.5 mg/L。蔗糖分別為：10、20、30 g/L。接種30 d 后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)（表1）。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)青龍?jiān)鲋诚禂?shù)的影響Table1 Effect of medium types on the proliferation of Acer palmatum ‘seiryu’

1.3.3 生根培養(yǎng)

將株高2～3 cm，帶有4 片以上葉片的無(wú)根壯苗，轉(zhuǎn)接到以1/2 WPM 為基本培養(yǎng)基，分別添加0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mg/LNAA 的生根培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基接種22 瓶，每瓶4 株，重復(fù)3 次，進(jìn)行生根培養(yǎng)。30 d 記錄根數(shù)，根長(zhǎng)，生根株數(shù)，最后計(jì)算平均根數(shù)，平均根長(zhǎng)，平均生根率。

1.3.4 煉苗移栽

將組培室培養(yǎng)30 d 后的生根苗放到自然環(huán)境條件下，放置3～5 d。擰開(kāi)組培瓶瓶蓋，放置2 d，定時(shí)進(jìn)行葉片噴水保濕，保證葉片伸展無(wú)卷葉焦葉，促使組培苗適應(yīng)自然環(huán)境條件。將組培苗從瓶中取出，在清水中洗掉培養(yǎng)基，放到5%的高錳酸鉀溶液中消毒5 min，最后，用自來(lái)水清洗干凈，移栽到珍珠巖∶蛭石∶泥炭土體積比為1 ∶1 ∶1的基質(zhì)中，定時(shí)噴淋，30 d 后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。移栽成活率 = 存活苗數(shù)/移栽苗數(shù) × 100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

啟動(dòng)率=莖段萌芽數(shù)/接種后無(wú)菌莖段總數(shù)×100%；增殖系數(shù)=誘導(dǎo)后不定芽總數(shù)/原接種莖段總數(shù)；平均根數(shù)=總生根根數(shù)/生根株數(shù)×100%；平均根長(zhǎng)=總生根根長(zhǎng)/生根根數(shù)×100%；生根率=生根個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 和Excel 2003 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)培養(yǎng)

以青龍莖段為外植體，接種于添加TDZ 的WPM 培養(yǎng)基中（表2），7 d 左右腋芽開(kāi)始萌發(fā)，葉柄脫落，隨后，腋芽莖段伸長(zhǎng)。從表2中可以得出，TDZ 濃 度 在0.01～0.05 mg/L 時(shí)，隨 著TDZ 濃度的升高，啟動(dòng)率逐漸升高；TDZ 濃度在0.05～0.09 mg/L 時(shí)，TDZ 濃度的升高，啟動(dòng)率逐漸降低。最終篩選出青龍最佳啟動(dòng)率培養(yǎng)基為：WPM + 0.05 mg/L TDZ + 30 g/L 蔗糖 + 6.5 g/L 瓊脂，啟動(dòng)率為96.1%，其芽生長(zhǎng)快，葉片較綠，莖段較粗，基部愈傷組織小。

2.2 增殖培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)啟動(dòng)培養(yǎng)的腋芽切下，接種到表3中的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。從表3中得出，培養(yǎng)基中添加物對(duì)青龍?jiān)鲋秤胁煌绊憽DZ 對(duì)青龍的增殖影響較大，其次，生長(zhǎng)素IBA，但外源添加物蔗糖對(duì)青龍?jiān)鲋秤绊懖伙@著。3 種物質(zhì)對(duì)青龍?jiān)鲋匙饔庙樞驗(yàn)椋篢DZ ＞IBA ＞蔗糖。TDZ 在青龍的繼代培養(yǎng)中，作用最大，其R值為1.53。TDZ 的3 個(gè)濃度梯度0.04、0.06 和0.08 mg/L，其K值分別是2.30、3.83 和3.03，可見(jiàn)，青龍的增殖系數(shù)并不是隨著TDZ 濃度的增加而增加。不同處理組合都有不同程度的增殖，其增殖系數(shù)最大的是5 號(hào)培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為4.8。青龍?jiān)鲋匙罴雅囵B(yǎng)基為：WPM+0.06 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA+瓊脂6.5 g/L+ 蔗糖30 g/L。

表3 不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)青龍?jiān)鲋车挠绊慣able3 Effects of different plant growth regulators on the proliferation of Acer palmatum ‘seiryu’

從表4方差分析中看出，在青龍繼代過(guò)程中，TDZ 對(duì)增殖系數(shù)影響最大，其F值56.713，在0.05 水平達(dá)到顯著；其次為生長(zhǎng)素IBA，其F值為22.250，在0.05 水平達(dá)到顯著。其蔗糖，F(xiàn)值為7.107，在0.05 水平不顯著。此結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。

表4 不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)青龍?jiān)鲋秤绊懙姆讲罘治鯰able4 Variance analysis of plant growth regulators on the proliferation of Acer palmatum ‘seiryu’

2.3 生根培養(yǎng)

將繼代培養(yǎng)一周期（30 d），高度1～3 cm的單株接種到添加不同濃度NAA 的生根培養(yǎng)基中。15 d 左右根基部凸起，根原基形成，20 d 從根原基上長(zhǎng)出嫩根，30 d 根長(zhǎng)至3 cm 左右。從表5中可以看出，NAA 濃度在0.1～0.3 mg/L，隨著NAA 濃度的升高，平均根長(zhǎng)逐漸升高，平均根數(shù)逐漸增加。NAA 濃度在0.3～0.5 mg/L，平均根長(zhǎng)、平均根數(shù)和生根率逐漸下降，而NAA 濃度0.3 mg/L 時(shí)，生根較快，根系較粗，生根時(shí)間短，生根率較高。最終，篩選出青龍生根培養(yǎng)基為1/2 WPM + 0.3 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂 + 30 g/L蔗糖，其生根率達(dá)96.7%。

表5 不同濃度NAA對(duì)青龍生根的影響Table5 Effects of different concentrations of NAA on rooting of Acer palmatum ‘seiryu’

2.4 煉苗移栽

移栽30 d 后，青龍組培苗的成活率達(dá)到90%以上。移栽50 d，青龍組培苗葉片舒展變大，葉片深綠色，頂芽有新葉長(zhǎng)出。

3 結(jié)論與討論

基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，由于各種植物的遺傳背景、生物學(xué)特性不同，因而對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的需求也不同，選擇合適的培養(yǎng)基對(duì)于組織培養(yǎng)至關(guān)重要[2-3]。本實(shí)驗(yàn)以木本培養(yǎng)基WPM 為基本培養(yǎng)基，添加各種植物激素，促進(jìn)腋芽誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、生根誘導(dǎo)，均達(dá)到較好的效果，這與談凱等研究日本紅楓愈傷組織誘導(dǎo)分化的研究相一致[4]。

TDZ 作為一種高效的細(xì)胞分裂素，在啟動(dòng)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)中的作用已在包括元寶楓等槭屬植物組培中得到證明[5]。在青龍啟動(dòng)培養(yǎng)過(guò)程中，使用0.01 mg/L TDZ 啟動(dòng)率低，僅為55%；使用0.05 mg/L TDZ 啟動(dòng)率較高，為96.1%；當(dāng)TDZ 使用濃度為0.09 mg/L 時(shí)，啟動(dòng)率為63%。低濃度的TDZ 促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)，這與植物激素的雙重性一致。TDZ 使用濃度為0.09 mg/L 時(shí)，因濃度較高，青龍組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致有效苗數(shù)減少，進(jìn)而降低了腋芽的啟動(dòng)率。最終優(yōu)選出啟動(dòng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為WPM + 0.05 mg/L TDZ + 30 g/L 蔗糖 + 6.5 g/L 瓊脂，啟動(dòng)率為96.1%。

在叢生芽誘導(dǎo)過(guò)程中隨著TDZ 濃度的不斷增高，芽體出現(xiàn)了一定的愈傷化甚至是玻璃體化現(xiàn)象[6-7]。有研究顯示，低濃度的TDZ 可以誘導(dǎo)芽的分化，高濃度的TDZ 則會(huì)誘導(dǎo)愈傷組織的形成抑制芽的分化[8]。TDZ 濃度增加到一定程度時(shí)則會(huì)使玻璃體化發(fā)生率提高[9]。由此可見(jiàn)，TDZ 的使用的臨界濃度是控制分化方向的關(guān)鍵。在青龍?jiān)鲋尺^(guò)程中，TDZ 和IBA 組合使用，達(dá)到了較好的增殖效果，這與王強(qiáng)等研究鱷嘴花的組織培養(yǎng)和快速繁殖的研究結(jié)果相一致[10]。最終優(yōu)選增殖培養(yǎng)基為：WPM + 0.06 mg/L TDZ + 0.3 mg/L IBA + 6.5 g/L 瓊脂 + 30 g/L 蔗糖。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，其種類(lèi)與組合對(duì)培養(yǎng)物的器官發(fā)育起主要誘導(dǎo)作用，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)為外源非營(yíng)養(yǎng)性的化學(xué)物質(zhì)，通常可在植物體內(nèi)傳導(dǎo)至作用部位，以很低的濃度就能促進(jìn)或抑制其生命過(guò)程的某些環(huán)節(jié)，使之向人類(lèi)的需求發(fā)展。莖芽生根是植物實(shí)現(xiàn)組培快繁的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和瓶頸問(wèn)題，在組培苗生根過(guò)程，添加的激素和濃度是影響組培苗生根的重要因素[11]。在組織培養(yǎng)生根過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞分裂素的濃度高于生長(zhǎng)素或只用細(xì)胞分裂素時(shí)有利于不定芽的誘導(dǎo)，當(dāng)只用一定濃度的生長(zhǎng)素或者配合使用低濃度的細(xì)胞分裂素時(shí)有利于不定根的誘導(dǎo)[12-13]。在青龍誘導(dǎo)生根過(guò)程中，單獨(dú)使用生長(zhǎng)素NAA 達(dá)到了較好的效果，最終篩選出最佳生根培養(yǎng)基：1/2 WPM+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖，其生根率達(dá)96.7%。

目前，對(duì)日本紅楓組培有少許報(bào)道，但針對(duì)日本紅楓青龍品種的組培研究至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究從獲得青龍無(wú)菌外植體、啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)及煉苗移栽，成功建立了青龍組培快繁體系，為青龍工廠化育苗奠定理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

本研究以青龍莖段為外植體，誘導(dǎo)叢生芽，建立組培快繁體系，但未對(duì)青龍的葉片、葉柄、種子等材料進(jìn)行相關(guān)組培的研究，下一步可以以不同外植體材料誘導(dǎo)愈傷組織、再生植株、體細(xì)胞等途徑，建立完善的青龍組培體系，為轉(zhuǎn)基因、遺傳育種、多倍體誘導(dǎo)奠定理論基礎(chǔ)。