古誠鑫?王坤元?余柑祥?王芝蕾?甘靜娣?盧倩廷?楊濤?楊輝

【摘要】目的 探討核受體Nur77對人肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。方法 采用蛋白免疫印跡法檢測人正常肝細胞L02及肝癌細胞株SMMC-7721、Bel-7402、Hep3B、SK-Hep1和HepG2的Nur77蛋白基礎(chǔ)表達水平。根據(jù)不同細胞株Nur77蛋白的表達情況，采用蛋白免疫印跡法分別驗證應(yīng)用siRNA沉默SMMC-7721和Hep3B細胞及過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞48 h后Nur77蛋白表達水平。并利用Transwell小室探討沉默或過表達Nur77對肝癌細胞遷移、侵襲的影響。結(jié)果 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示與其他肝癌細胞株相比，Nur77蛋白在正常人肝細胞中表達稍低，在SMMC-7721和Hep3B高表達，而在HepG2細胞中的表達最低。因此，我們用Nur77 siRNA處理SMMC-7721和Hep3B細胞并與未處理組（siGFP對照組）進行比較，Nur77過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞。Transwell小室結(jié)果顯示與siGFP對照組相比，Nur77 siRNA處理組在SMMC-7721和Hep3B兩種細胞中的遷移和侵襲數(shù)目均減少（P均< 0.05）。與pENTER空載質(zhì)粒對照組相比，Nur77過表達組HepG2細胞的遷移和侵襲數(shù)目顯著增多（P均< 0.05）。結(jié)論 Nur77可能通過促進肝癌細胞的遷移和侵襲從而介導(dǎo)肝癌的進展。

【關(guān)鍵詞】肝細胞癌;細胞核受體Nur77;遷移;侵襲

Effect of nuclear receptor Nur77 on migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells Gu Chengxin， Wang Kunyuan， Yu Ganxiang， Wang Zhilei， Gan Jingdi， Lu Qianting， Yang Tao， Yang Hui. Depar-tment of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China

Corresponding author， Yang Tao， E-mail： ytabc2007@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of nuclear receptor Nur77 on the migration and invasion of human hepatocellular carcinoma cells. ?Methods The basic expression levels of Nur77 protein in normal human liver cell line L02 and liver cancer cell lines SMMC-7721， Bel-7402， Hep3B， SK-Hep1 and HepG2 were detected by Western blot. According to the expression of Nur77 protein in different cell lines， the expression of Nur77 protein was detected by Western blot after silencing Nur77 in SMMC-7721 and Hep3B cells and overexpressing Nur77 in HepG2 cells for 48 h. Meanwhile， the effect of silencing or overexpressing Nur77 upon the migration and invasion of the hepatocellular carcinoma cells was evaluated by using Transwell chamber. ?Results Western blot demonstrated that Nur77 protein was slightly expressed in normal human hepatocytes compared with those in other hepatocellular carcinoma cell lines. Nur77 protein was highly expressed in SMMC-7721 and Hep3B cells， whereas the least expressed in HepG2 cells. Therefore， we treated SMMC-7721 and Hep3B cells with Nur77 siRNA and compared them to the untreated group （siGFP control group）， and the Nur77-overexpression plasmid was transfected into HepG2 cells. Compared with the siGFP control group， the number of migration and invasion of both SMMC-7721 and Hep3B cells was significantly decreased in the Nur77 siRNA group（all P < 0.05）. Compared with the pENTER empty plasmid control group， the quantity of migration and invasion of HepG2 cells was significantly increased in the Nur77-overexpression group（both P < 0.05）. ?Conclusion Nur77 mediates the progression of liver cancer probably by promoting the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;Nuclear receptor Nur77;Migration;Invasion

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球第五位，而死亡率則為第三位[1-2]。肝癌細胞的遷移和侵襲能力是導(dǎo)致肝癌多發(fā)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的重要因素，對參與肝癌遷移和侵襲的靶向分子的研究是治療肝癌的重要方向。有研究表明，Nur77（又稱神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的基因B）參與很多生物學(xué)調(diào)控的過程，包括炎癥、代謝和凋亡等多方面，并且對腫瘤細胞的增殖和血管形成均有重要的作用[3-4]。此外，與正常組織相比，Nur77在包括結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中高表達，并且與腫瘤分級、遠處轉(zhuǎn)移風險、整體患者存活率密切相關(guān)[5-6]。在結(jié)腸癌的研究中可以發(fā)現(xiàn)，Nur77可以通過調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞的上皮間質(zhì)化（EMT）促進結(jié)腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。同樣，也有研究表明，人肝癌組織Nur77的高表達與腫瘤的分化程度、門靜脈血栓形成、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[7]。然而，Bian等[8]研究卻發(fā)現(xiàn)Nur77可以通過拮抗PEPCK1的降解來介入糖代謝的途徑而抑制肝癌的進展。因此，Nur77在肝癌中的作用仍存在爭議，而Nur77對肝癌細胞的遷移和侵襲的影響也不明確。本研究通過基因沉默和高表達Nur77后探究肝癌細胞遷移和侵襲能力的改變情況，明確Nur77在肝癌細胞遷移和侵襲中的作用。

材料與方法

一、材 料

試劑及耗材DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清購自美國Gibco公司。陰性對照siGFP購自美國CST公司，人特異性Nur77 siRNA購自蘇州吉瑪公司。人特異Nur77 pENTER及其對照購自山東維真生物科技公司。遷移、侵襲小室購自美國康寧公司。PVDF膜購自美國西格瑪公司。

二、細胞培養(yǎng)和處理

細胞L02和SMMC-7721來源于上海中國科學(xué)院細胞庫，Bel-7402、Hep3B、SK-Hep1、HepG2來源于美國ATCC細胞庫。人肝癌細胞置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中，加入含10%胎牛血清及青霉素（100 Unit/ml）和鏈霉素（1 μg/ml）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞處理時，人肝癌細胞均勻鋪在6孔板內(nèi)，利用LipofectamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染siRNA，或者利用LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染pTENTER高表達及對照質(zhì)粒。48 h收獲細胞并通過蛋白免疫印跡法驗證蛋白中Nur77的表達量。

三、蛋白免疫印跡法

當肝癌細胞（Hep3B、SMMC-7721、HepG2）分別轉(zhuǎn)染siRNA或質(zhì)粒48 h后，分別將正常培養(yǎng)一定時間及轉(zhuǎn)染的對照組（siGFP組）、實驗組（Nur77 siRNA組）細胞用RIPA裂解液于冰上提取細胞中的總蛋白，BCA濃度梯度定量法測定并調(diào)整樣本至相同蛋白濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗脫后加入對應(yīng)一抗稀釋液于4℃低溫搖床上孵育過夜。次日TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min，加入適宜濃度脫脂奶粉配制的對應(yīng)種屬二抗常溫低速搖床孵育2 h。洗滌PVDF膜后滴加HRP化學(xué)發(fā)光液避光孵育5 min，用X線片于曝光機顯影并定影。

四、細胞遷移和侵襲實驗

人肝癌細胞均勻鋪于6孔板后，分別轉(zhuǎn)染siRNA或Nur77高表達質(zhì)粒，作用48 h后，使用胰酶消化細胞并計數(shù)細胞，約5×105/小室。等量的細胞加入提前準備好的Transwell小室的上室中，約100 ～ 200 微升/小室，下室中加入800 ml含10%胎牛血清的正常細胞培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)箱孵育7 ～ 8 h，觀察并用結(jié)晶紫染色遷移下室膜中的細胞數(shù)目，于400倍放大白光顯微鏡攝像后計數(shù)統(tǒng)計。侵襲小室的孵育時間約延長1倍（16 h）后同樣方法觀察下室膜中細胞數(shù)目情況。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布資料以表示，組間比較采用t檢驗;非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、正常肝細胞及不同肝癌細胞株的Nur77蛋白表達水平

蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，在5種肝癌細胞株中，Hep3B和SMMC-7721的Nur77蛋白基礎(chǔ)表達水平最高，而HepG2的表達最低（圖1）。因此選用Hep3B和SMMC-7721兩個細胞株進行siRNA干擾實驗，選用HepG2細胞株進行質(zhì)粒高表達實驗。此外，可檢測到正常肝細胞L02的Nur77蛋白水平表達，提示Nur77并不是腫瘤的特異性表達蛋白。

二、肝癌細胞株Nur77 siRNA干擾及Nur77質(zhì)粒高表達后蛋白表達水平

在Hep3B和SMMC-7721細胞中均發(fā)現(xiàn)，與siGFP組相比，Nur77 siRNA組的Nur77蛋白水平降低（圖2），提示siRNA干擾實驗的作用明顯。此外，在HepG2細胞中，與pENTER空白對照組相比，pENTER-Nur77組的Nur77蛋白表達水平上升（圖2），這也提示pENTER-Nur77的高表達質(zhì)粒作用顯著。

三、Nur77 siRNA抑制Hep3B和SMMC-7721細胞株的遷移及侵襲

Transwell小室細胞實驗結(jié)果顯示，在陰性對照siGFP和Nur77 siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細胞48 h后，與siGFP對照組相比，相同數(shù)目的Nur77 siRNA組

transwell小室中培養(yǎng)8 h后下室中的細胞數(shù)目減少[10.0（4.5，18.0）vs. 4.0（2.2，6.0），Z = -3.89，P < 0.01]，見圖3A。提示Nur77 siRNA能顯著抑制肝癌細胞Hep3B的遷移。侵襲實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與siGFP對照組相比，轉(zhuǎn)染48 h后相同細胞數(shù)目的Nur77 siRNA組transwell小室中培養(yǎng)16 h

后下室中的細胞數(shù)目減少[10.0（9.0，14.0）vs. 5.0（4.0，6.0），Z = -6.57，P < 0.01]，見圖3A。提示Nur77 siRNA對肝癌細胞Hep3B的侵襲也具有明顯的抑制作用。

此外，在SMMC-7721細胞中進行遷移和侵襲實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48 h后，相同細胞數(shù)目的Nur77 siRNA組transwell小室培養(yǎng)一定時間后的下室細胞數(shù)目均較siGFP組減少[97.0（93.5，100.0）vs. 49.0（44.5，55.2），Z = -5.84;42.5（32.0，50.8） vs. 14.0 （12.0，17.0），Z = -4.73，P均< 0.05]，見圖3B。提示Nur77 siRNA抑制SMMC-7721細胞的遷移和侵襲能力。

四、Nur77 高表達促進HepG2細胞的遷移和侵襲

利用transwell小室檢測肝癌細胞HepG2的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pENTER空載質(zhì)粒對照組比較，相同細胞數(shù)目的Nur77高表達組在遷移小室培養(yǎng)

8 h后下室細胞數(shù)目增多[（18.0±3.3）vs. （21.1± 6.8），t = -2.33，P < 0.05]，見圖4。結(jié)果提示Nur77 高表達促進HepG2細胞的遷移。同時，相同細胞數(shù)目和組別的HepG2細胞在含基質(zhì)膠的transwell小室中培養(yǎng)16 h后，Nur77 高表達組細胞數(shù)目增多[4.0（3.0，5.0） vs. 6.0（5.0，8.8），Z = -3.30，P < 0.05]，見圖4。結(jié)果提示Nur77高表達促進HepG2細胞的侵襲。

討論

遷移和侵襲是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，是涉及多種因素的生物學(xué)行為。而腫瘤的遷移和侵襲能力與患者的預(yù)后密切相關(guān)，也是衡量疾病進展的重要指標[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nur77在肝癌細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮了重要作用。在明確不同肝癌細胞株的Nur77蛋白表達水平并不相同后，通過敲低高Nur77本底表達量的SMMC-7721和Hep3B兩種細胞株，發(fā)現(xiàn)Nur77 siRNA組與對照組相比，肝癌細胞的遷移和侵襲得到顯著抑制。相反的，高表達Nur77后的HepG2細胞遷移和侵襲則顯著增強。

目前，Nur77在肝癌中的作用仍有爭議，它對于肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用并不明確，且于不同腫瘤間發(fā)揮著促癌或抑癌的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Nur77在包括胃癌、大腸癌和前列腺癌等多種腫瘤中高表達，并且能通過加速細胞周期進程， 增加S/G2期的細胞數(shù)目等方式發(fā)揮促癌作用[11]。更為重要的是，Nur77在血管形成中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。Zeng等研究（2006年）發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A可以通過激活Nur77的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用促進血管的生成。盡管在未成熟胸腺瘤細胞或T細胞雜交瘤中，Nur77分子能通過促進細胞凋亡而發(fā)揮抑癌的作用，但Nur77在多種腫瘤中均證實發(fā)揮著促癌的作用并且與患者的預(yù)后密切相關(guān)[12]。此外，Nur77還具有促進腫瘤細胞遷移的作用。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在臨床的結(jié)直腸癌組織中可以檢測到Nur77蛋白的高表達，而Nur77的高表達與晚期腫瘤、淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移階段、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和存活率差均有顯著的相關(guān)性。體內(nèi)外研究也發(fā)現(xiàn)，在基因沉默Nur77蛋白后細胞遷移和侵襲能力均下降，而高表達Nur77則出現(xiàn)相反的結(jié)果。本研究也發(fā)現(xiàn)，在SMMC-7721和Hep3B這兩種肝癌細胞中，基因沉默Nur77蛋白的表達顯著抑制肝癌細胞的遷移、侵襲。而高表達Nur77則可以觀察到遷移和侵襲的顯著增強。這與在結(jié)腸癌中的研究情況類似，也表明肝癌細胞中Nur77的表達可能與肝癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和存活率密切相關(guān)。

有研究表明，在結(jié)腸癌細胞中，組織缺氧會刺激Nur77和β-catenin分子的共表達，并形成相互反饋的循環(huán)回路[14]。這種循環(huán)回路也誘導(dǎo)癌細胞穿過基質(zhì)膜屏障，誘導(dǎo)癌細胞入侵。當過表達Nur77或β-catenin時均能導(dǎo)致上皮細胞的標記蛋白E-cadherin表達量的下降，以及間皮細胞標記蛋白N-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)酶（MMP）-2的上調(diào)，進而促進EMT，強化腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。另外，Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Nur77可以通過直接與MMP-9啟動子結(jié)合，激活MMP-9的轉(zhuǎn)錄，激活癌細胞的轉(zhuǎn)移，促使腫瘤的進展和惡化。

Nur77是孤核受體家族中通過與相應(yīng)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，調(diào)控基因表達和轉(zhuǎn)錄從而參與腫瘤遷移和侵襲的蛋白受體。它可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期或促進VEGF合成促進腫瘤的增殖，也可以通過改變BCL-2的表型并靶向轉(zhuǎn)移作用于線粒體發(fā)揮促細胞凋亡的作用[15]。在結(jié)腸癌細胞中，Nur77通過可調(diào)節(jié)β-catenin或EMT從而促進腫瘤的遷移和侵襲。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中，Nur77同樣可以發(fā)揮促進腫瘤遷移和侵襲的特性，但是否類似的通過β-catenin或EMT來發(fā)揮作用仍需進一步研究。本課題擬通過探討Nur77在肝癌遷移和侵襲的作用，為肝癌發(fā)病機制研究提供新的方向，為肝癌治療潛在靶點提供一定的理論基礎(chǔ)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-06-18）

（本文編輯：楊江瑜）