柯松 王敏*徐源 王文凱 劉載陽

目前的大多數(shù)研究均表明，殼聚糖對多種微生物包括細(xì)菌、真菌等都具有抑制效果[1]。本文主要綜述殼聚糖對細(xì)菌和真菌抑制效果的研究進(jìn)展。殼聚糖的抑菌性能影響因素眾多且復(fù)雜，目前已研究的影響因素主要有分子量、濃度、脫乙酰度、pH 值、金屬離子、菌株、晶型等[2]，多種因素之間又有相互交錯作用，使得目前對殼聚糖抑菌性影響因素的評價試驗較為困難。本文將從抑菌性影響因素及其抑菌機(jī)制等方面進(jìn)行總結(jié)，探討近年來的研究結(jié)果，為更深入、細(xì)致了解殼聚糖抑菌性能提供理論基礎(chǔ)及科學(xué)參考。

1 殼聚糖的抑菌性能特點

1.1 不同分子量殼聚糖的抑菌性能

分子量是殼聚糖抑菌性的重要影響因素，也是目前殼聚糖抑菌性研究的熱點。但是關(guān)于分子量與抑菌性的定量規(guī)律尚不明確。宋獻(xiàn)周等[3]研究了幾種不同分子量的-殼聚糖（平均分子量分別為 MW=1.56×104，3.3×104，9.5×104，7.2×105）對大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等細(xì)菌的抑菌性，實驗以繪制細(xì)菌生長曲線表示抑菌性，結(jié)果顯示低分子量的-殼聚糖具有更慢的細(xì)菌生長曲線，從而認(rèn)為低分子量的-殼聚糖具有更好的抑菌效果。然而，Younsook 等[4]的研究卻發(fā)現(xiàn)高分子量的殼聚糖溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果要高于低分子量殼聚糖溶液，并且認(rèn)為在分子量小于30×104Da 時，殼聚糖溶液對金黃色葡萄球菌的抑制效果隨分子量減少而逐漸減弱。鄭連英等[5]對于大腸桿菌抑菌規(guī)律的研究與宋獻(xiàn)周等[3]相似，由表1 可以看出，分子量越低，抑菌性越強(qiáng)；但表2 中顯示，對于金黃色葡萄球菌，當(dāng)分子量為30 萬以下時，隨著分子量降低，抑菌性減弱。

表1 殼聚糖對E.coli 的抗菌能力（%）

表2 殼聚糖對St.aureus 的抗菌能力（%）

他們研究殼聚糖分子量對抑菌性影響在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中得出不同的結(jié)論，提示菌種也是不可忽視的重要影響因素。也有人認(rèn)為，造成不同分子量抑菌效果研究結(jié)果混亂的另一原因是沒有對殼聚糖分子量大小進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的劃分。目前殼聚糖分子量高低沒有具體標(biāo)準(zhǔn)，普遍認(rèn)為低分子量為分子量＜50 kDa；中等分子量為50 kDa～150 kDa；高分子量為分子量＞150 kDa[6]。

1.2 不同濃度殼聚糖的抑菌性能

很多研究都表明，殼聚糖溶液濃度與其抑菌性能大致成正相關(guān)性。謝勇等[7]的研究表明，在同等酸性條件下，pH值為6.5 和5.5 時，當(dāng)殼聚糖的濃度從1.5%增加到4%時，殼聚糖對幽門螺桿菌抑菌作用增強(qiáng)，但是當(dāng)濃度達(dá)到4%以后，抑菌作用不再增強(qiáng)。楊聲等[8]的研究控制殼聚糖分子量為5×104，隨著濃度增加，抑菌圈直徑越大，表明抑菌效果越明顯；但當(dāng)濃度達(dá)到1.5%時，變化不再明顯，此即為最佳抑菌濃度。相關(guān)機(jī)制研究認(rèn)為隨著殼聚糖濃度的增大，溶液中—NH2的濃度增加，而殼聚糖發(fā)揮抑菌效果需要在酸性溶液中。當(dāng)在酸性溶液中，—NH2易與H+結(jié)合形成NH4+，而NH4+的增多，對于細(xì)菌（帶負(fù)電荷）的靜電吸引力增強(qiáng)，使更多的細(xì)菌被絮凝、聚沉，從而抑制了細(xì)菌的生長繁殖，增強(qiáng)了抑菌效果[9]。

1.3 不同脫乙酰度（或乙酰度）殼聚糖的抑菌性能

分子量和脫乙酰度是影響殼聚糖抑菌性的兩種獨(dú)立因素，且有研究表明分子量對殼聚糖抑菌性的影響要大于脫乙酰度的影響[10]。目前普遍的研究結(jié)論是脫乙酰度越高，殼聚糖抑菌性越高[6]。Suzuki K 等[11]研究認(rèn)為乙?；臄?shù)目和位置對多糖的活性影響較大。故也有從改變脫乙酰度的角度來改變殼聚糖活性的相關(guān)研究。王鴻等[12]研究了分子量較大的殼聚糖（9.3×105～9.8×105）中3 種不同脫乙酰度殼聚糖（DD=81.8%，78.4%，61.3%）的抑菌性，他們研究的對象為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。用顯微鏡計數(shù)細(xì)菌在3種不同脫乙酰度殼聚糖溶液的液體蛋白胨培養(yǎng)基的生長量來表示抑菌性，其研究結(jié)果顯示，當(dāng)控制殼聚糖溶液均為濃度0.2%，pH 值6.0 時，不同脫乙酰度殼聚糖溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均相對對照組有抑菌性，且隨脫乙酰度增加抑菌性增大。馮小強(qiáng)等[13]研究結(jié)果得出相似的規(guī)律，并且分析其可能機(jī)制為：殼聚糖的脫乙?；癁槠浞肿渔溕系挠H脂性基團(tuán)—NHCOCH3被親水性基團(tuán)—NH2取代的過程；因此脫乙酰度的增大，使得殼聚糖溶液中—NH2增多，抑菌效果增強(qiáng)。

1.4 不同pH 值殼聚糖的抑菌性能

殼聚糖只有在酸性溶液中才具有抑菌性，并且溶液的pH 值越低，抑菌活性越強(qiáng)[14]。荊迎軍等[15]的研究也證實，殼聚糖的抑菌活性隨pH 值的降低（從6.0 降低到4.0）而增高，并且通過多因素方差分析認(rèn)為pH 值是一個極顯著的影響因素。這可能是因為在較低的pH 值情況下，更多的氨基帶正電荷，使其與帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面相互作用增強(qiáng)。然而大多數(shù)研究都忽略了一個事實，酸性溶液本身就具有抑菌效果，因此最終的實際抑菌效果可能是酸性溶液中的H+和殼聚糖中的—NH2基團(tuán)共同作用的結(jié)果[16]。針對這一疑問，Jung J 等[17]進(jìn)行了進(jìn)一步研究，他們通過對比乙酸、乳酸、鹽酸以及酸溶解殼聚糖對大腸桿菌的抑制效果。其結(jié)果表明酸溶解殼聚糖溶液相對于等量的酸溶液來說具有更強(qiáng)的抑菌效果，這種額外抑菌率最高可增達(dá)65%。因此表明，殼聚糖的部分抑菌效果是因為溶液中的酸性成分或者其他活性碎片產(chǎn)生的。

1.5 不同菌株對殼聚糖抑菌性能的影響

荊迎軍等[15]的方差分析認(rèn)為，雖然殼聚糖的分子量、pH 值等因素都是殼聚糖抑菌活性的極顯著影響因素，但菌株本身才是殼聚糖抑菌活性大小的關(guān)鍵因素。在多項研究中都表明殼聚糖對于革蘭氏陽性菌的抑菌效果相對于革蘭氏陰性菌更強(qiáng)[18-21]。胡瑛等[22]也研究了不同分子量的殼聚糖對6種測試菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、棒狀桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌）的最低抑菌濃度MIC 值。其研究中，分子量為8.7 萬的殼聚糖對金黃色葡萄球菌的MIC為0.05%，對大腸桿菌的MIC 為0.1%。也同樣說明，殼聚糖對革蘭氏陽性菌的抑菌性比對革蘭氏陰性菌更為敏感。

1.6 金屬離子對殼聚糖抑菌性的影響

荊迎軍等[15]研究了金屬離子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Li+）對殼聚糖抑菌性的影響，認(rèn)為金屬離子可顯著降低殼聚糖的抑菌活性，并且對革蘭氏陰性菌的影響大于革蘭氏陽性菌，他的研究認(rèn)為Ca2+、Mg2+的影響最大，顯著降低了殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌性。當(dāng)金屬離子到達(dá)一定濃度時，殼聚糖會完全失去抑菌活性。陳威等[23]在殼聚糖溶液加入不同濃度金屬離子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+）后，殼聚糖溶液的抑菌效果明顯受到影響，當(dāng)金屬離子濃度達(dá)到一定程度時，殼聚糖完全失去抑菌活性。Bingjun Q 等[24]也研究金屬離子對殼聚糖溶液抑菌效果的影響，他們的實驗研究認(rèn)為當(dāng)加入Co2+和Ni2+時則可以顯著增加殼聚糖的抑菌活性，而加入K+、Na+、Li+則顯著削弱殼聚糖的抑菌活性。

1.7 改性殼聚糖的抑菌性能

盡管殼聚糖的抑菌性能已被大多實驗證實，但原生殼聚糖分子量大，只能溶解于一些酸性溶液中，不能直接溶于水。這在一定程度上限制了殼聚糖抑菌性的應(yīng)用。因此近年來，對殼聚糖改性，尤其以增加其水溶性成為研究殼聚糖抑菌性能的熱點。水溶性殼聚糖在溶液中可以分離形式存在，擁有延長構(gòu)象，能夠使反應(yīng)更加充分[25]，從而可以更高效地抑制細(xì)菌生長。如何增加水溶性是殼聚糖發(fā)揮抑菌效果的關(guān)鍵。水溶性殼聚糖衍生物可以通過在多聚鏈上引進(jìn)持久的正電荷獲得。也有研究者通過降低殼聚糖顆粒的尺寸，使其微?；瑥亩纳破湟志Ч鸞26-28]。

2 殼聚糖的抑菌機(jī)制

近年來，隨著研究的深入，人們對于殼聚糖抑菌機(jī)制已經(jīng)有了較為深刻的認(rèn)識，但就其確切抑菌機(jī)制至今來說還尚不十分明確。目前普遍認(rèn)可的殼聚糖抑菌機(jī)制有3 種說法：殼聚糖中的NH4+與帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜反應(yīng)，從而改變細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞外的營養(yǎng)成分無法向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸[29]；或者是因為細(xì)胞膜通透性改變導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)容物（例如鉀離子以及其他低分子量的蛋白質(zhì)）滲出致裂解死亡。殼聚糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電的物質(zhì)（主要是蛋白質(zhì)和核酸）結(jié)合，使細(xì)胞的正常生理功能（例如DNA 的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成等）受到影響，抑制細(xì)菌的繁殖，導(dǎo)致微生物的死亡。殼聚糖作為一種螯合劑，選擇性地螯合對微生物生長起關(guān)鍵作用的金屬離子，從而抑制微生物的生長和產(chǎn)毒[30]。但是目前關(guān)于不同分子量的殼聚糖抑菌性的研究有很多不一致的觀點，甚至相反的結(jié)論。許多學(xué)者認(rèn)為可能是高分子量殼聚糖和低分子量殼聚糖存在不同的抑菌機(jī)制；也有人認(rèn)為可能是殼聚糖對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌機(jī)制存在不同。各種機(jī)制的相互交錯影響使得目前研究殼聚糖抑菌性及抑菌機(jī)理顯得不甚清晰。了解清楚殼聚糖的抑菌機(jī)制，將有助于在將來的研究中更加具體地把控殼聚糖的抑菌性。以下將從分子量和菌種兩個角度概括目前對殼聚糖抑菌機(jī)制的認(rèn)識研究。

2.1 殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌機(jī)制

Helander 等[31]抑菌機(jī)制的研究認(rèn)為殼聚糖破壞了革蘭氏陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)。李曉芳等[32]以大腸桿菌作為代表，考察了殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌性。通過測定菌液中加入疏水性熒光探劑后熒光強(qiáng)度的改變，考察了殼聚糖對外膜滲透性的影響。其研究結(jié)果表明：因為革蘭氏陰性菌表面的負(fù)電荷，殼聚糖可與其細(xì)胞膜發(fā)生靜電作用，增加細(xì)胞膜的滲透性，而使細(xì)胞膜破壞，導(dǎo)致菌體死亡。然而也有人認(rèn)為對于革蘭氏陰性菌的抑菌機(jī)制是殼聚糖主要通過滲透到細(xì)菌體內(nèi)，吸附陰離子物質(zhì)從而干擾細(xì)胞代謝[33]。

2.2 殼聚糖對革蘭氏陽性菌的抑菌機(jī)制

革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，特點是厚度大。有研究認(rèn)為殼聚糖對于革蘭氏陽性菌的抑菌機(jī)制主要是在菌體表面形成致密的外膜，抑制細(xì)胞膜的通透性，從而阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)來達(dá)到抑菌目的。因此隨著殼聚糖分子量的增加，其對革蘭氏陽性菌的作用是逐漸增強(qiáng)的。鄭連英等[34]的研究應(yīng)證了這一規(guī)律。

2.3 高分子量殼聚糖的抑菌機(jī)制

陳威等[23]研究了兩種不同分子量（5 kDa 和50 kDa）殼聚糖引起金黃色葡萄球菌鉀離子及ATP 滲漏的情況，其結(jié)果顯示分子量為50 kDa、濃度為1%的殼聚糖引起金黃色葡萄球菌和白色念珠菌鉀離子滲漏量較分子量為5 kDa，濃度為1%的殼聚糖溶液引起鉀離子的滲漏量多，并且兩者均較對照組濃度為0.5%的乙酸溶液引起鉀離子的滲漏量多，ATP 的滲漏情況與上述鉀離子的滲漏情況類似。而現(xiàn)有的大多數(shù)研究均表明低分子量的殼聚糖具有更好的抑菌效果。因此推測了高分子量的殼聚糖溶液可能是通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來抑制細(xì)菌生長的。而低分子量殼聚糖很可能存在與高分子量殼聚糖不同的抑菌機(jī)制。

2.4 低分子量殼聚糖的抑菌機(jī)制

Xiao 等[35]的研究中用FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記低分子量殼聚糖，并與大腸桿菌一起培養(yǎng)。經(jīng)過熒光檢測顯示，在大腸桿菌的細(xì)胞體內(nèi)存在大量被標(biāo)記的分子量為8 000 U和4 000 U 的殼聚糖。其推測可能是由于低分子量的殼聚糖通過滲透的方式進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。帶有正電荷的殼聚糖與帶有負(fù)電荷的DNA 發(fā)生相互作用，從而影響了RNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，從而實現(xiàn)了抑菌。

3 討論

本文回顧了殼聚糖抑菌性的研究進(jìn)展。普遍認(rèn)為殼聚糖具有良好的抑菌活性，可有效地抑制細(xì)菌生長，而且抑菌活性高，抗菌譜廣。但國內(nèi)外學(xué)者對其抑菌性能的影響因素存在許多不一致觀點，甚至不同的研究得出完全相反的結(jié)論，很大程度上限制了殼聚糖的應(yīng)用。其主要爭論在以下幾點：分子量對殼聚糖抑菌性定量規(guī)律。目前普遍認(rèn)為分子量相對低的殼聚糖有更好的抑菌效果，但是對具體多低分子量的殼聚糖具有較好的抑菌效果尚未定論。目前對高分子量的殼聚糖抑菌試驗得出研究結(jié)論尚無法一致。分析認(rèn)為，多數(shù)試驗均采用不同平均分子量殼聚糖作為研究對象，但是在相近的平均分子量殼聚糖中高分子量殼聚糖和低分子量殼聚糖的比例可以完全不相同。因此，即使完全一樣的平均分子量殼聚糖在相同實驗條件下也可能得出不同的實驗結(jié)果。平均分子量殼聚糖掩蓋了高分子量殼聚糖和低分子量殼聚糖的比例關(guān)系，導(dǎo)致對不同分子量殼聚糖抑菌性研究相對困難。在今后的研究中，可以嘗試對高分子量殼聚糖和低分子量殼聚糖進(jìn)行篩選后分別研究。隨著殼聚糖濃度增加，其抑菌性也增強(qiáng)，但抑菌效果不會隨著濃度增大而無限增強(qiáng)。普遍認(rèn)為，殼聚糖在特定分子量、特定pH 時，針對某種菌時會有最適抑菌濃度，超過該濃度，殼聚糖的抑菌效果將不會增強(qiáng)，甚至可能下降。對于殼聚糖溶液抑菌性能的應(yīng)用應(yīng)該注意到此規(guī)律。并期待今后的研究中對最適抑菌濃度的相關(guān)研究能夠更深入。而脫乙酰度、pH 值、金屬離子等對殼聚糖抑菌性的影響，結(jié)論較為一致。在研究中可作為相對固定的控制變量，會使殼聚糖抑菌規(guī)律分析更加容易。不同分子量殼聚糖、殼聚糖對不同菌種之間可能存在不同的抑菌機(jī)制。但目前的研究多是假設(shè)及推論，下一步對殼聚糖抑菌機(jī)制的研究仍然是其抑菌性能研究中的熱點，如果可以利用分子生物學(xué)方法從基因?qū)用嫒パ芯科湟志裕瑢α私鈿ぞ厶且志攸c及更好應(yīng)用殼聚糖具有更大幫助。