董軍 楊曉 刁攀 梁寶寶 蔡璇 王旭斌 賀西京*

上頸椎融合術(shù)是治療寰樞關(guān)節(jié)不穩(wěn)的一種重要的手術(shù)方法[1]。按手術(shù)入路的不同可分為經(jīng)口咽入路融合術(shù)和經(jīng)后路融合術(shù)兩種。由于椎體融合使得原有椎體節(jié)段運(yùn)動(dòng)功能喪失，融合術(shù)被認(rèn)為是加速鄰近節(jié)段退變的重要因素之一。頸椎鄰近節(jié)段退變是指出現(xiàn)的鄰近于融合節(jié)段的頸椎疾病，通常表現(xiàn)為頸部疼痛、上肢或手部感覺(jué)過(guò)敏或減退、椎間隙變窄、骨贅形成等一系列臨床癥狀或影像學(xué)變化[2-3]。鄰近節(jié)段退變的確切病因目前尚缺乏統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，對(duì)于該疾病的研究多集中在生物力學(xué)上。目前發(fā)現(xiàn)，融合后的頸椎的運(yùn)動(dòng)功能在融合節(jié)段上消失但重新分布于鄰近的椎間隙內(nèi)。在鄰近節(jié)段退變的諸多變化中，椎間隙變窄為該疾病較早的改變，其實(shí)質(zhì)為椎間盤(pán)的退變，其內(nèi)的一系列膠原蛋白的含量和分布隨之發(fā)生變化。椎間盤(pán)內(nèi)的膠原纖維通過(guò)膠原蛋白肽鏈形成具有特定的三維空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得椎間盤(pán)具有高度的抗張強(qiáng)度和韌性。椎間盤(pán)退變時(shí)具有顯著變化特征的為Ⅰ型膠原蛋白的變化。纖維環(huán)具有多層、有序排列的同軸心薄層結(jié)構(gòu)，其內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白有序分布[4]，Ⅰ型膠原蛋白主要分布于纖維環(huán)的外層，且其含量由外向內(nèi)逐漸遞減[5]。隨著年齡的增長(zhǎng)、椎間盤(pán)退變的進(jìn)行，Ⅰ型膠原蛋白在纖維環(huán)內(nèi)的表達(dá)逐漸增加，髓核內(nèi)也出現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白[6-7]。這種膠原含量及分布的改變使得椎間盤(pán)內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其承受能力降低，在臨床上表現(xiàn)出纖維環(huán)破裂、髓核脫出。

寰樞關(guān)節(jié)為頸椎中旋轉(zhuǎn)功能最大的解剖結(jié)構(gòu)，其旋轉(zhuǎn)功能約占整個(gè)頸椎的50%[8]。寰樞關(guān)節(jié)融合后，其原有的旋轉(zhuǎn)功能將由下頸椎代償。為了解上述生物力學(xué)的改變能否加速鄰近節(jié)段退變，筆者試圖通過(guò)直接觀察頸椎間盤(pán)內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的分布變化來(lái)了解對(duì)鄰近節(jié)段退變所造成的影響。鑒于犬的寰樞關(guān)節(jié)和人的寰樞關(guān)節(jié)在解剖結(jié)構(gòu)上極為相似且同樣具備靈活的旋轉(zhuǎn)功能，為進(jìn)一步了解上頸椎融合術(shù)對(duì)鄰近節(jié)段的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立犬的上頸椎融合模型觀察C2-3椎間盤(pán)內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的變化，初步了解上頸椎融合術(shù)對(duì)鄰近椎間盤(pán)的影響。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)是在嚴(yán)格遵守本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)要求的條件下完成的。

1.1 主要儀器

寰樞融合鋼板6 具，本實(shí)驗(yàn)中所用寰樞關(guān)節(jié)融合鋼板為本課題組自行設(shè)計(jì)的一款專(zhuān)用于犬的“工”字型鈦合金假體（西北有色金屬研究院加工）（見(jiàn)圖1A）。該假體厚度為2 mm，在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)具體犬的寰齒關(guān)節(jié)形態(tài)預(yù)折彎為與之相適應(yīng)的形狀。含4 個(gè)直徑在3.5 mm 左右的螺釘孔（見(jiàn)圖1B）。

圖1 上頸椎融合鈦板、術(shù)中照片和術(shù)后即刻X 線：A.上頸椎融合板；B.術(shù)中安放于C1-2 的融合鈦板；C.術(shù)后即刻正位X 線；D.術(shù)后即刻側(cè)位X 線

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

成年健康雄性家犬12 只（由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院外科動(dòng)物中心提供），平均體重：（23.0±0.5）kg。均禁食24 h、禁飲12 h 以排空胃腸道，并經(jīng)后肢體表靜脈建立靜脈通道。每只犬予以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，經(jīng)靜脈通道注射麻醉，待犬出現(xiàn)呼吸淺慢、角膜反射遲鈍、舌外伸時(shí)，為麻醉適宜表現(xiàn)。若出現(xiàn)呼吸抑制，立即給予腎上腺素2 mL、尼可剎米0.375 mg 靜脈推注，輔助擠壓胸廓輔助呼吸搶救。全麻生效后，行X 線檢查排除實(shí)驗(yàn)以檢查患寰樞關(guān)節(jié)有無(wú)異常。明確無(wú)異常后將12 只犬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各6 只。

1.2.2 模型建立

手術(shù)過(guò)程：將上述全麻生效的實(shí)驗(yàn)組犬肌注青霉素鈉（320 U/只），并行頸前區(qū)備皮。備負(fù)壓吸引器2 臺(tái)，分別用于術(shù)區(qū)清潔和術(shù)中呼吸道分泌物的清除。取犬仰臥位，并將犬頸部向前反曲，充分暴露咽以下頸部，稀釋碘伏反復(fù)消毒咽部后鋪置無(wú)菌巾單。以正中手術(shù)切口，逐層切開(kāi)咽后壁，充分顯露寰椎前結(jié)節(jié)、前弓、側(cè)塊和樞椎椎體。根據(jù)上述解剖形態(tài)，將“工”形融合板用折彎器預(yù)折呈所需形態(tài)。用直徑為3.0 mm 鉆頭分別在寰椎側(cè)塊和樞椎關(guān)節(jié)突下鉆孔，并用測(cè)深測(cè)量孔的深度，選取適宜長(zhǎng)度螺釘，依次擰入4 枚螺釘(見(jiàn)圖1B)。待徹底止血后，逐層縫合肌層、黏膜層、皮膚切口。為防止頸部水腫造成器官壓迫，術(shù)后不予環(huán)形石膏固定而以前后條形石膏托固定。對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)處理。

術(shù)后護(hù)理：術(shù)后犬能自行站立并走動(dòng)認(rèn)為麻醉完全蘇醒，可輔以飲水及流質(zhì)食物。各組犬分籠飼養(yǎng)，每籠1 只，術(shù)后肌注青霉素（80 萬(wàn)單位）3 d，預(yù)防感染；并注意保暖，每天更換1 次敷料?？刂剖覝卦?8 ～20℃；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能夠在籠內(nèi)自由活動(dòng)。

影像學(xué)觀察：術(shù)后立即拍攝頸椎正、側(cè)位X 線片。觀察人工關(guān)節(jié)假體有無(wú)松動(dòng)、脫釘、斷裂。

材料獲取與保存：于術(shù)后3 個(gè)月，通過(guò)注射大劑量戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組犬。解剖頸椎獲取C2-3椎間盤(pán)并立即放入4%多聚甲醛溶液（10%福爾馬林）中固定至24 h，然后用于免疫熒光染色的部分轉(zhuǎn)移至20%蔗糖溶液中脫水過(guò)夜，用濾紙吸干多余水分置入凍存管放入液氮罐中保存?zhèn)浔鶅銮衅褂?。其余椎間盤(pán)用于HE 染色固定。

1.2.3 HE 染色

將上述保存在4%多聚甲醛里的組織塊進(jìn)行固定至72 h后，以濃度20%～90%乙醇作脫水劑，由低到高逐漸脫去上述組織塊中的水分。置于二甲苯中透明，并以石蠟包埋，切成厚度為5 ～8 m 厚的薄皮。將切片放入伊紅-蘇木精染色液（HE）中染色2 ～3 min，在共聚焦顯微鏡下攝片。依據(jù)椎間盤(pán)退變組織學(xué)評(píng)分表（見(jiàn)表1）[9]，將上述HE 染色的椎間盤(pán)進(jìn)行評(píng)分。

表1 椎間盤(pán)退變組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)

1.2.4 免疫熒光染色

將保存在液氮罐內(nèi)的C2-3椎間盤(pán)取出，置于室溫下恢復(fù)溫度，包埋于固定架上，用鋒利刀片在-10℃下進(jìn)行均勻切片，厚度為8 m；在室溫下將原放置于濕盒內(nèi)的冰凍切片吹干；用PBS 緩沖液在室溫下振洗2 次，每次5 min；將上述切片用0.1%胰蛋白酶在37℃恒溫箱下孵育10 min，進(jìn)行抗原修復(fù)；在室溫下，再用PBS 緩沖液振蕩清洗2 次，每次5 min；滴加一抗(Collagen-Ⅰ-antibody，ABCAM 公司，編號(hào)：ab23446)(稀釋度1∶200），切片過(guò)夜孵育后于室溫下，用PBS 緩沖液清洗2 次，每次5 min；滴加二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體，南京凱基生物科技有限公司，編號(hào)：KGAA)(稀釋度1∶50)。孵育封片后置于熒光顯微鏡下觀察。將在同一曝光時(shí)間(75 ms)，發(fā)射波長(zhǎng)為495 nm條件下進(jìn)行攝片，得到免疫熒光圖像，隨機(jī)選取并記錄5 個(gè)視野。利用Image-Pro Plus 6.0 軟件將圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像，并進(jìn)行光密度測(cè)量，獲得每個(gè)椎間盤(pán)的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。將光密度結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行雙側(cè)獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)。對(duì)組織學(xué)評(píng)分采用Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)。＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后均能正常飲食，未見(jiàn)傷口感染，術(shù)后肢體功能未見(jiàn)明顯異常。術(shù)后3 個(gè)月兩組犬均行大劑量戊巴比妥鈉靜脈注射安樂(lè)死。

2.1 X 線檢查

術(shù)后X 線檢查提示假體固定于C1和C2椎體，4 枚螺釘分別置于寰椎側(cè)塊或樞椎關(guān)節(jié)突下方。未見(jiàn)鋼板斷裂、螺釘脫出等（見(jiàn)圖1C、圖1D）。

2.2 C2-3 椎間盤(pán)HE 染色

HE 染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組犬C2-3椎間盤(pán)纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，膠原纖維束間裂隙增大，髓核減少。對(duì)照組犬C2-3椎間盤(pán)纖維環(huán)結(jié)構(gòu)呈有序環(huán)狀分布，排列整齊、規(guī)則、縱橫交錯(cuò)、大小及方向一致，無(wú)團(tuán)塊樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組椎間盤(pán)組織學(xué)評(píng)分平均為1.5 分，對(duì)照組椎間組織學(xué)評(píng)分平均為0.5 分（=3.105，＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖2 犬C2-3 椎間盤(pán)外觀照片及HE 染色圖片：A.實(shí)驗(yàn)組椎間盤(pán)外觀照片；B.對(duì)照組椎間盤(pán)外觀照片；C.實(shí)驗(yàn)組C2-3 椎間盤(pán)HE 染色（×100）；D.實(shí)驗(yàn)組C2-3 椎間盤(pán)HE 染色（×100）；E.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組椎間盤(pán)評(píng)分，*表示＜0.05

2.3 C2-3 椎間盤(pán)免疫熒光染色

免疫熒光染色圖發(fā)現(xiàn)正常組犬C2-3椎間盤(pán)內(nèi)膠原纖維排列整齊，膠原走行清楚，膠原纖維環(huán)與髓核之間的過(guò)渡區(qū)較寬，纖維環(huán)呈同心圓排列規(guī)則整齊，實(shí)驗(yàn)組犬C2-3椎間盤(pán)纖維環(huán)中增生的膠原纖維排列紊亂，纖維環(huán)排列不規(guī)整，腫脹明顯并呈結(jié)節(jié)樣團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)裂隙及斷裂(見(jiàn)圖3A、圖3B)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組犬C2-3椎間盤(pán)Ⅰ型膠原蛋白較對(duì)照組增加（見(jiàn)表2），實(shí)驗(yàn)組C2-3椎間盤(pán)光密度為（391 052.98±18 869.81），對(duì)照組C2-3椎間盤(pán)光密度為（312 945.42±22 400.47），經(jīng)雙側(cè)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩組光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=6.532，＜0.001）（見(jiàn)圖3C）。

表2 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組犬C2-3 椎間盤(pán)免疫熒光圖像光密度

圖3 免疫熒光染色圖片：A.實(shí)驗(yàn)組C2-3 椎間盤(pán)內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白（白色箭頭）（×200）；B.對(duì)照組C2-3 椎間盤(pán)內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白（白色箭頭）（×200）；C.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組C2-3 椎間盤(pán)光密度值，**表示＜0.001

3 討論

上頸椎融合術(shù)是治療上頸椎骨折、不穩(wěn)等的主要術(shù)式[1]。隨著該術(shù)式在臨床的應(yīng)用，其安全性和有效性已經(jīng)得到廣泛證實(shí)，但在融合后C1-2旋轉(zhuǎn)功能大大喪失是該術(shù)式不可避免的問(wèn)題之一。近年來(lái)，融合后鄰近節(jié)段退變這一問(wèn)題受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前對(duì)于該疾病的病因尚缺乏統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，對(duì)于鄰近節(jié)段退變的研究多集中在生物力學(xué)研究上。研究發(fā)現(xiàn)，融合后頸椎的運(yùn)動(dòng)功能在融合節(jié)段上消失但重新分布于鄰近的椎間隙內(nèi)[10]。上述變化的直接結(jié)果使得鄰近節(jié)段的運(yùn)動(dòng)范圍較原有的增大且伴隨著鄰近椎間盤(pán)和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)內(nèi)的壓力增加。

椎間盤(pán)是高度特異性的軟骨性組織[11]，由骨性終板、軟骨終板、外層纖維環(huán)和內(nèi)層髓核組成。它是脊柱吸收震蕩、減緩沖擊，為脊柱提供穩(wěn)定性并保持脊柱一定活動(dòng)范圍的重要結(jié)構(gòu)。纖維環(huán)的大體形態(tài)呈同心圓狀排列，纖維環(huán)所含的膠原蛋白在每一層均有序排列。作為椎間盤(pán)的主要組成部分，膠原蛋白占纖維環(huán)干重的50%～70%，占髓核干重的15%～20%[12-13]。纖維環(huán)是非均一的韌性組織，主要由Ⅰ型膠原蛋白和蛋白聚糖組成；髓核是均一的凝膠狀組織，主要由蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白組成[14]。

Nerlich 等[15]證實(shí)椎間盤(pán)內(nèi)存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ型膠原蛋白。其中I 型膠原蛋白形態(tài)粗大，集中分布于纖維環(huán)的周邊，具有較強(qiáng)的抗拉伸性能，為抵抗鄰近椎體過(guò)度運(yùn)動(dòng)提供良好的支持作用。上述多種膠原蛋白互相交聯(lián)形成具有特定三維結(jié)構(gòu)的膠原交聯(lián)，該結(jié)構(gòu)是維持椎間盤(pán)生物力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)框架的重要因素之一，尤其是膠原交聯(lián)的種類(lèi)和程度決定了膠原的機(jī)械性能[15]。膠原含量和種類(lèi)的差異進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白多糖、水等細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，最終使得椎間盤(pán)不同區(qū)域承受負(fù)荷和應(yīng)力的能力不同，進(jìn)而使得椎間盤(pán)損傷的機(jī)會(huì)增加，表現(xiàn)為纖維環(huán)破裂、髓核突出等。但究其本質(zhì)而言，椎間盤(pán)的退變過(guò)程即為其內(nèi)原有正常膠原纖維空間結(jié)構(gòu)改變的過(guò)程。呂振華、西永明等[6-7]通過(guò)核酸分子原位雜交技術(shù)觀察Ⅰ型膠原蛋白在人椎間盤(pán)的表達(dá)規(guī)律，認(rèn)為伴隨年齡的增長(zhǎng)、椎間盤(pán)退變的進(jìn)行，Ⅰ型膠原蛋白在纖維環(huán)內(nèi)的表達(dá)逐漸增加。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組椎間盤(pán)內(nèi)Ⅰ型膠原表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示寰樞椎融合術(shù)能加速鄰近C2-3椎間盤(pán)的退變。

理論上，對(duì)于脊柱融合術(shù)鄰近節(jié)段的退變?cè)诮M織學(xué)水平上的出現(xiàn)要較影像學(xué)上更早。而文獻(xiàn)上報(bào)道組織學(xué)鄰融合節(jié)段的C2-3椎間盤(pán)出現(xiàn)顯著性差異至少在半年以上，本研究中實(shí)驗(yàn)組犬C2-3椎間盤(pán)在術(shù)后3 個(gè)月后Ⅰ型膠原蛋白的顯著增加，提示上頸椎融合術(shù)更早加速C2-3椎間盤(pán)的退變。

本實(shí)驗(yàn)有如下局限性，僅建立了動(dòng)物模型而未進(jìn)一步觀察接受上頸椎融合術(shù)后患者鄰近椎間盤(pán)的核磁共振信號(hào)變化，以便更好了解C2-3椎間盤(pán)在人體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。僅對(duì)一種膠原蛋白即Ⅰ型膠原蛋白進(jìn)行了間接定性觀察，缺乏深入的定量研究。