劉玙平 馮秋霞 王翠娜 王運(yùn)霞

(1河南衛(wèi)生干部學(xué)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450007；2河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院婦產(chǎn)科；3河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，其死亡率和發(fā)病率分別居?jì)D科惡性腫瘤第1位和第3位〔1〕。由于卵巢癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，超過70%的患者就診時(shí)已屬晚期，難以治愈，5年存活率僅40%〔2，3〕。手術(shù)治療、放療、化療是卵巢癌的主要治療方式，但其存在的各種毒副作用嚴(yán)重影響其治療效果；生物治療、分子靶向治療、免疫治療等治療方法也給中晚期卵巢癌患者的治療提供了更多選擇〔4，5〕。微小RNA(miRNA)廣泛存在于真核生物中，能調(diào)控多種下游靶基因參與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育等生物過程〔6〕。miRNA失調(diào)可促進(jìn)或抑制多種癌癥，其在惡性腫瘤領(lǐng)域的研究受到了廣泛關(guān)注〔7〕。研究〔8，9〕表明，miR-148在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中異常表達(dá)，并調(diào)節(jié)癌細(xì)胞凋亡、分化、代謝等過程；而miR-145已被證實(shí)在卵巢癌組織及血清中呈低表達(dá)〔10〕。為研究miR-145對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，本文檢測(cè)了過表達(dá)miR-145后卵巢癌細(xì)胞凋亡率及其相關(guān)因子水平，以期為卵巢癌的早期診斷及治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年5月就診于河南省人民醫(yī)院并經(jīng)病理科確診為卵巢癌的患者共46例，年齡31～79歲。收集所有患者經(jīng)手術(shù)切除的卵巢癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距離病灶≥2 cm)并立即存放于液氮，帶回后儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用；所有患者術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等其他治療并簽署知情同意書，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2材料 OVCAR3細(xì)胞(批號(hào)：HTB-161)購自ATCC；胎牛血清(批號(hào)：SH41288)、RPMI1640培養(yǎng)液(批號(hào)：SH30807)購自美國Gibco-BRL公司；兔抗人Bax多克隆抗體(批號(hào)：22160002)購自上海煊翎生物科技有限公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體(批號(hào)：PAB19877)、兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3 多克隆抗體(批號(hào)：ABP52935)、兔抗人核因子(NF)-κB p65多克隆抗體(批號(hào)：ABP51955)購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人β-actin多克隆抗體(批號(hào)：XFC1655)購自上海信帆生物科技有限公司；NF-κB抑制劑(PDTC，批號(hào)：S1809)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號(hào)：P5318)、總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0101)、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0131)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0033)購自上海碧云天生物科技有限公司；Trizol試劑(批號(hào)：15596)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號(hào)：PC0020)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號(hào)：BSP0161)、RIPA裂解液(批號(hào)：R0020)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：D0010)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(批號(hào)：PE0030)購自北京Solarbio公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)：11668027)購自美國Invitrogen公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：RR047A)、TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(批號(hào)：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：170207)購自美國Coulter公司；酶標(biāo)儀購自Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；NanoDrop微量核酸測(cè)定儀購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10 %胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)OVCAR3細(xì)胞。待細(xì)胞生長至融合度約50%時(shí)，將細(xì)胞分組，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染模擬物(mimic)對(duì)照(control)、miR-145 mimics、抑制劑(inhibitor)control、miR-145 inhibitor至OVCAR3細(xì)胞并依次標(biāo)記為miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組、anti-miR-145組。將OVCAR3細(xì)胞重懸并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)/ml，接種至96孔板，設(shè)置ddH2O組(未添加PDTC)和PDTC組(含終濃度100 μmol/L的PDTC)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；轉(zhuǎn)染miR-145 mimics的細(xì)胞使用含終濃度為10 mg/L TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)12 h并標(biāo)記為miR-145+ TNF-α組。

1.4RT-qPCR 取適量卵巢癌及癌旁組織，miR-con組和miR-145組細(xì)胞，充分研磨，加入Trizol試劑提取總RNA。使用NanoDrop微量核酸測(cè)定儀和凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量，分別使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并配制反應(yīng)體系。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。β-actin引物：上游：5′-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3′，下游：5′-TCGGCCACATTGTGAACTTT-3′；miR-145引物：上游：5′-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′，下游：5′-TGGTGTCGTGGACTCG-3′；miR-145相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用F=2-△△Ct法。

1.5Western印跡 收集對(duì)數(shù)生長期的miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組和anti-miR-145組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解，4℃，8 459.1 r/min離心20 min，取上清。取適量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳結(jié)束后將蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h；分別加入兔抗人Bax多克隆抗體(1∶5 000)、兔抗人Bcl-2多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Caspase-3多克隆抗體(1∶500)、兔抗人p65多克隆抗體(1：1 000)、兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜，ECL試劑盒顯示條帶。以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 收集OVCAR3細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將p65 3′-UTR野生型(Wt)質(zhì)粒載體(含p65 3′-UTR片段)或突變型(Mut)質(zhì)粒載體(不含p65 3′-UTR片段)分別與mimic control和miR-145 mimics共轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)24 h。裂解后4℃，8 459.1 r/min離心10 min收集上清液，檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶活性。相對(duì)熒光強(qiáng)度=螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度。

1.7ROS、MDA、SOD水平檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后的miR-con組、miR-145組、ddH2O組、PDTC組和miR-145+ TNF-α組細(xì)胞去除上層培養(yǎng)液，以無血清培養(yǎng)液稀釋雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA)加入使其終濃度為10 μmol/L，加入到各組細(xì)胞中，室溫避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長525 nm下檢測(cè)細(xì)胞二氯熒光黃(DCF)熒光強(qiáng)度，反映ROS生成水平。

各組細(xì)胞于冰上裂解，離心收集上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入0.2 ml MDA檢測(cè)工作液，混勻，沸水浴15 min，冷卻至室溫后酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，計(jì)算MDA含量；蛋白上清液中加入酶工作液，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，計(jì)算SOD活力。

1.8細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染后的miR-con組、miR-145組、ddH2O組、PDTC組和miR-145+TNF-α組細(xì)胞，胰酶消化后4℃、1 337.5 r/min離心收集。按照Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-145在卵巢癌組織中低表達(dá) miR-145在卵巢癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(0.34±0.16 vs 1.00±0.23,P<0.05)。

2.2過表達(dá)miR-145誘導(dǎo)OVCAR3細(xì)胞凋亡 與miR-con組比較，miR-145組細(xì)胞上清液中ROS和MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)；miR-145組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 過表達(dá)miR-145對(duì)OVCAR3細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表1 OVCAR3細(xì)胞中miR-145高表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.3miR-145靶向調(diào)控p65蛋白表達(dá) 通過Targetscan在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，p65 3′-UTR上存在miR-145的結(jié)合位點(diǎn)(圖2)，表明p65可能是miR-145的潛在靶基因；miR-145組p65 3′-UTR Wt質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性明顯低于miR-con組(P<0.05)，而與p65 3′-UTR Mut粒共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表2；miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組、anti-miR-145組p65蛋白表達(dá)分別為：(0.99±0.03)、(0.46±0.04)、(1.03±0.05)、(1.54±0.06)。在OVCAR3細(xì)胞中過表達(dá)miR-145，p65蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，抑制miR-145則p65蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖3。

圖2 miR-145與p65互補(bǔ)序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

2.4抑制NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)ROS產(chǎn)生并誘導(dǎo)OVCAR3細(xì)胞凋亡 對(duì)比ddH2O組，PDTC組細(xì)胞上清液中ROS和MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)；細(xì)胞凋亡率顯著增大(P<0.05)。見表3。

1～4:miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組、anti-miR-145組圖3 各組細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)

表3 NF-κB信號(hào)通路抑制劑對(duì)卵巢癌ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡的影響

2.5miR-145下調(diào)NF-κB p65產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)OVCAR3細(xì)胞凋亡 過表達(dá)miR-145上調(diào)OVCAR3細(xì)胞上清液中ROS和MDA水平(P<0.05)，并顯著降低SOD水平(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；miR-145+TNF-α組細(xì)胞上清液中ROS和MDA水平及細(xì)胞凋亡率較miR-145組顯著降低(P<0.05)，SOD水平較miR-145組顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 NF-κB激活劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞ROS和凋亡的影響

與miR-con組相比：1)P<0.05；與miR-145組相比：2)P<0.05

3 討 論

miRNA是內(nèi)源性非編碼RNA，是轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，其調(diào)節(jié)方式主要通過與靶mRNA 3′-UTR特異性結(jié)合〔11〕。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，多種miRNA可作為癌癥診斷的標(biāo)志物，通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成并改善患者預(yù)后〔12，13〕。其中，miR-145在食管鱗狀細(xì)胞癌、三陰性乳腺癌等腫瘤組織中呈低表達(dá)，并且能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腫瘤抑制作用〔14，15〕。而Zhang等〔16〕分析發(fā)現(xiàn)：多種miRNA分子在卵巢癌組織中異常表達(dá)，其中miR-145在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果與上述結(jié)論〔16〕一致。NF-κB主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，能夠與B細(xì)胞免疫球蛋白κ親鏈基因增強(qiáng)子特異性結(jié)合，由p50、p52、p65、cRel、RelB 5種蛋白組成，是介導(dǎo)腫瘤和炎癥發(fā)生的主要內(nèi)在途徑〔17〕。NF-κB是具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，其活化后減少癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)并誘導(dǎo)產(chǎn)生抗凋亡蛋白，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡〔18〕。p65是分布和作用范圍廣泛的NF-κB因子之一，有研究〔19〕表明：沉默NF-κB p65 可上調(diào)Bax蛋白表達(dá)并抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類，激活Caspase-3可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；并通過p65調(diào)節(jié)NF-κB活性〔20，21〕。通過干擾p65可激活Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔22〕。ROS水平過高可導(dǎo)致蛋白變性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化及DNA損傷；MDA由細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化生成；SOD是生物體內(nèi)天然抗氧化酶；細(xì)胞內(nèi)ROS水平失衡可激活細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔23，24〕。

綜上所述，在卵巢癌組織中，miR-145表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-145可通過上調(diào)ROS水平并抑制NF-κB p65蛋白表達(dá)從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。這一研究結(jié)果為卵巢癌的早期診斷及臨床治療提供理論基礎(chǔ)，有可能為卵巢癌的治療提供新靶點(diǎn)。