金惠杰，邱昆成，李嘉華，林愛華，劉奕明

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥藥代動力學(xué)實驗室，廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510120)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的生理病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為胰島素敏感性降低，不能促進(jìn)外周靶組織(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)的葡萄糖攝取和利用[1]。IR被認(rèn)為是引發(fā)T2DM的始動因素[2]，改善IR對T2DM的治療及防治并發(fā)癥具有重要意義。

T2DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，病機特點為陰虛為本、燥熱為標(biāo)。知母-黃柏藥對(Zhimu-Huangbaiherbpair，ZB)出自《蘭室秘藏》，又名療本滋腎丸，二者相須為用，主治陰虛燥熱、骨蒸盜汗，是典型的治療消渴的藥對[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，知母-黃柏藥對中的芒果苷、知母皂苷、小檗堿等有效成分對IR均具有改善作用[4-6]，而其作為治療消渴的典型藥對，對IR的影響目前尚不清楚。因此，本研究建立T2DM大鼠模型及HepG2細(xì)胞IR模型，從糖脂代謝方面探討藥對知母-黃柏對IR的藥效作用。

1 材料

1.1 藥物與試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，純度>98%，Sigma公司，批號: 111607-200301，用前用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解；無脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，購于北京索萊寶公司；棕櫚酸鈉、油酸鈉，均購自Sigma公司，加超純水于75 ℃水浴溶解完全后，與無脂肪酸BSA溶液混勻并過濾除菌，用前采用培養(yǎng)液稀釋成含3% BSA、1 mmol·L-1棕櫚酸(palmitic acid，PA)和2 mmol·L-1油酸(oleic acid，OA)的高脂添加劑；DMEM高糖培養(yǎng)基、南美胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液，均購自美國Gibco公司；胰島素ELISA試劑盒，購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶法檢測試劑盒，購自南京建成；甘油三脂(triglyceride，TG)檢測試劑盒，購自北京普利萊；鹽酸二甲雙胍，購自中美上海施貴寶制藥有限公司。

黃柏(批號: 141112771，產(chǎn)地四川)、知母(批號: 140806121，產(chǎn)地河北)飲片，均購自廣東康美藥業(yè)股份有限公司，用前粉碎至適當(dāng)細(xì)度并過篩，知母黃柏按1 ∶1比例充分混合(低劑量組20 g ∶20 g，高劑量組60 g ∶60 g)，之后置于圓底燒瓶，加純水至250 mL，浸泡0.5 h后，回流裝置煎煮1 h，過濾，加入純水250 mL繼續(xù)煎煮1 h，過濾，合并濾液，濃縮并定容至200 mL，于4 ℃冰箱保存，用于動物灌胃給藥。以上濃縮液取部分，置于-80 ℃冰箱預(yù)凍后，放入已事先降至預(yù)定溫度的冷凍干燥機中，干燥24 h，得到知母-黃柏藥對凍干粉，4 ℃冰箱保存，用于細(xì)胞給藥，用前采用培養(yǎng)液溶解并濾菌。

1.2 實驗動物與細(xì)胞SPF級♂SD大鼠，體質(zhì)量(180±10)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：(粵)44007200026586。動物飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度(20±2.0)℃，相對濕度40%～60%,照明晝夜明暗交替周期為12 h，所有大鼠自由攝食、飲水。高脂高糖飼料：蔗糖20%、豬油10%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪蛋白10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預(yù)混料0.4%、基礎(chǔ)飼料57.2%，由廣東省實驗動物中心提供。HepG2細(xì)胞株，來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 儀器AB135-S電子天平(Mettler Toledo公司)；Orion Star A211臺式pH測量儀(美國賽默飛世爾科技公司)；Synergy H1型多功能酶標(biāo)儀(美國佰騰儀器有限公司)；LDZ5-2臺式離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

2 方法

2.1 動物模型的建立SD大鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。隨機抽取6只大鼠作為正常組(Control)，普通飼料喂養(yǎng)，其余24只大鼠采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)。4周后，正常組大鼠按照10 mL·kg-1注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其余24只大鼠按照35 mg·kg-1劑量腹腔注射STZ。造模前禁食不禁水12 h，注射STZ后d 7檢測空腹血糖(fasting blood glucose, FBG), FBG>16.7 mmol·L-1為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 動物模型的分組及給藥24只大鼠造模成功后，隨機分為模型組(Model)、二甲雙胍組(Metformin)、知柏高劑量(ZB 4.5 g·kg-1)和低劑量(ZB 1.5 g·kg-1)組，每組6只。二甲雙胍組按0.25 g·kg-1灌胃給予鹽酸二甲雙胍混懸液，知柏高、低劑量組分別按照生藥4.5、1.5 g·kg-1灌胃給予知母-黃柏水煎液；模型組與正常組按照10 mL·kg-1灌胃生理鹽水。各組大鼠每天灌胃1次，連續(xù)給藥4周。

2.3 各組動物體質(zhì)量、FBG、胰島素、TG的檢測測定各組大鼠造模前(STZ注射前)與給藥前(STZ注射d 7)的空腹體質(zhì)量與空腹血糖。給藥4周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，再測1次空腹體質(zhì)量，乙醚麻醉后眼眶采血0.5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取血漿備用，用于檢測FBG、血清胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平及TG含量。FBG及FINS分別采用葡萄糖測定試劑盒和胰島素ELISA試劑盒測定。葡萄糖試劑盒為氧化酶法，胰島素試劑盒為雙抗夾心法，并按以下公式計算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index， ISI)和胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance index，Homa-IR)：ISI=ln[1/(FBG×FINS)]，Homa-IR=FBG×FINS/22.5。TG由廣東省實驗動物檢測所采用日立7020全自動生化分析儀檢測。

2.4 HepG2細(xì)胞IR模型的建立、分組及給藥HepG2細(xì)胞株用含10% FBS、1%青/鏈霉素的高糖DMEM，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以6 000個細(xì)胞每孔接種至96孔板，每孔200 μL，分為正常組(Control)、模型組(Model)、二甲雙胍組(Metformin，5 mmol·L-1)、知柏高、中、低劑量組(ZB生藥384、192、96 mg·L-1)，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞長至80%左右，正常組加入含3% BSA的培養(yǎng)液，其他各組加入含3% BSA、1 mmol·L-1PA和2 mmol·L-1OA的培養(yǎng)液分別誘導(dǎo)24 h，構(gòu)建IR模型，成功制備IR模型后給藥24 h。

2.5 HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量測定將HepG2細(xì)胞株接種至96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，培養(yǎng)方式及實驗分組同“2.4”，并設(shè)置空白對照孔。給藥24 h后，取上清，用葡萄糖氧化酶法檢測各實驗組培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量：葡萄糖消耗量=空白孔葡萄糖含量-測定孔葡萄糖含量?？紤]細(xì)胞增殖可能對葡萄糖消耗造成影響，各孔取上清后，再利用MTT法測定孔底細(xì)胞活力，用于校正葡萄糖消耗量(葡萄糖消耗量/細(xì)胞活力)。

2.6 HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量測定將HepG2細(xì)胞以每孔1.2×105個接種至6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，培養(yǎng)方式及實驗分組同“2.4”。給藥24 h后，棄各孔培養(yǎng)液，加細(xì)胞裂解液萃取細(xì)胞內(nèi)的TG，收集的細(xì)胞裂解液70 ℃加熱10 min后，2 000 r·min-1離心5 min，取上清，利用TG檢測試劑盒測定TG含量，并用BCA試劑盒測定其蛋白濃度，用于校正TG含量。

3 結(jié)果

3.1 知母-黃柏對糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響STZ注射前各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異，注射7 d后，模型組、二甲雙胍組、知柏高、低劑量組體質(zhì)量均明顯低于正常組(P<0.05)，大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿消瘦，即“三多一少”癥狀，符合糖尿病的臨床特征。給藥4周后，正常組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長，其他各組體質(zhì)量持續(xù)減輕，且明顯低于正常組(P<0.01)，模型組與各給藥組之間無明顯差異(Tab 1)。

Tab 1 Changes of rat weight in each

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2 知母-黃柏對糖尿病大鼠空腹血糖的影響STZ注射前，各組大鼠FBG值均差異無顯著性。STZ注射d 7，模型組、二甲雙胍組、知柏高、低劑量組FBG明顯高于正常組(P<0.01)，4組之間FBG差異無顯著性。給藥4周后，與模型組相比，二甲雙胍組、知柏高、低劑量組FBG均明顯降低(P<0.05)，各給藥組之間無明顯差異(Tab 2)。

Tab 2 Changes of rat FBG in each

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

3.3 知母-黃柏對糖尿病大鼠空腹胰島素的影響給藥前各組大鼠FINS含量差異均無顯著性。給藥4周后，與正常組相比，模型組FINS升高，ISI明顯下降(P<0.01)，Homa-IR明顯上升(P<0.01)，表明糖尿病模型大鼠體內(nèi)胰島素敏感性降低，胰島素抵抗指數(shù)升高，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗特征。與模型組相比，二甲雙胍組、知柏高、低劑量組ISI明顯升高(P<0.05)，Homa-IR明顯降低(P<0.01)；知柏高、低劑量組亦能明顯降低FINS含量(P<0.05)，二甲雙胍組FINS含量亦有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異(Tab 3)。

3.4 知母-黃柏對糖尿病大鼠TG的影響STZ注射d 7，模型組、二甲雙胍組、知柏高、低劑量組TG含量明顯高于正常組(P<0.05)，4組之間TG含量差異無顯著性。給藥4周后，模型組TG含量持續(xù)升高，明顯高于正常組(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組TG含量明顯降低(P<0.05)，各給藥組之間無明顯差異(Tab 4)。

3.5 知母-黃柏對HepG2胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響與正常組相比，模型組糖耗量明顯下降(P<0.01)；給予二甲雙胍或知柏高、中、低劑量后，細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯升高(P<0.05)，各給藥組與模型組之間細(xì)胞活性差異無顯著性(Tab 5)。

3.6 知母-黃柏對HepG2胰島素抵抗細(xì)胞TG含量的影響HepG2胰島素抵抗細(xì)胞的TG含量與正常組相比明顯升高(P<0.01)；二甲雙胍、知柏高、中劑量組TG含量相比模型組明顯下降(P<0.05)，知柏低劑量組亦有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ZB on 24 h TG content in HepG2 cell

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

4 討論

T2DM是威脅人類健康的重要代謝性疾病，其患病率呈逐漸增長的趨勢，而IR作為T2DM的重要特征，存在于整個疾病的發(fā)生發(fā)展過程，是研究T2DM發(fā)病機制的首選對象[7]。張蕾等[8]研究表明，高脂高糖飲食可以引起肝細(xì)胞內(nèi)TG過度堆積為主要病理特征的脂肪肝IR大鼠模型。本實驗利用STZ聯(lián)合高脂高糖飼料喂養(yǎng)的方法建立糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕的臨床“三多一少”癥狀，并且出現(xiàn)高血脂、高血糖、高Homa-IR及低ISI的生化指標(biāo)特征，符合T2DM基本特征IR的臨床特點，提示造模成功。

肝臟是調(diào)節(jié)機體能量平衡，尤其是糖、脂代謝的主要器官，因此，肝臟的IR在機體IR中占有重要地位。HepG2細(xì)胞源于人的肝胚胎瘤細(xì)胞株，在高水平的胰島素條件下，其表面胰島素受體的數(shù)目下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時間呈正相關(guān)[9]，因此HepG2細(xì)胞是體外研究IR發(fā)病機制和降糖藥物作用機制的理想細(xì)胞模型。高濃度游離脂肪酸可以導(dǎo)致肝臟脂肪沉積，促使糖脂代謝異常,從而引發(fā)IR[10]。本實驗采用含1 mmol·L-1棕櫚酸和2 mmol·L-1油酸的培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h，建立肝臟IR細(xì)胞模型。結(jié)果表明，細(xì)胞的葡萄糖消耗能力下降，胞內(nèi)TG含量升高，符合肝臟細(xì)胞IR的代謝特征，表明模型建立成功。

Tab 3 Changes of rat FINS in each n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Tab 4 Changes of rat TG in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Tab 5 Effect of ZB on 24 h glucose consumption in HepG2 cell model with insulin

**P<0.01vscontrol;##P<0.01,#P<0.05vsmodel

本實驗結(jié)果顯示，藥對知母-黃柏對糖尿病大鼠及HepG2胰島素抵抗細(xì)胞均有明顯的降糖、降脂作用，有效改善糖脂代謝紊亂癥狀。動物實驗中，相比給藥前、給藥4周后模型組的FBG及TG含量持續(xù)升高，而各給藥組FBG及TG含量無明顯改變,說明藥對知母-黃柏對糖尿病大鼠FBG及TG含量的進(jìn)一步升高有抑制作用，且作用強度與二甲雙胍相近。另外，二甲雙胍及知柏低劑量對糖尿病大鼠體質(zhì)量的降低有一定的緩和作用，而知柏高劑量組大鼠體質(zhì)量相對模型組有所降低，可能是因為知母和黃柏均為寒涼藥物，長期高劑量給藥導(dǎo)致大鼠脾虛，從而體質(zhì)量減輕的癥狀并無明顯改善。細(xì)胞實驗研究表明，知柏高、中劑量均能明顯增加HepG2胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗量，并同時降低TG含量，且中劑量作用強度稍強于二甲雙胍。另外，各給藥組細(xì)胞活力與模型組細(xì)胞活性基本一致，表明知母-黃柏的降糖作用不依賴于細(xì)胞的增殖。

二甲雙胍作為T2DM的首選藥物，其降糖機制主要是通過抑制肝臟糖異生，增加周圍組織對胰島素的敏感性，從而使血糖水平降低[11]。本文研究表明，藥對知母-黃柏高、低劑量均能明顯降低糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)及血漿胰島素水平，提升胰島素敏感指數(shù)，對IR具有一定的改善作用，且效果與二甲雙胍相當(dāng)。此結(jié)果提示，降低胰島素抵抗指數(shù)，提升胰島素敏感性是藥對知母-黃柏改善IR糖脂代謝紊亂的作用機制之一。

本文從動物及細(xì)胞水平證實了藥對知母-黃柏對IR具有明顯的改善作用，表明其作用是通過降低胰島素水平，提升胰島素敏感性，促進(jìn)糖脂代謝來實現(xiàn)的，為臨床指導(dǎo)用藥提供了重要依據(jù)。