梅詠玉，方 晨，丁少禎，劉曉昌，徐張巍，胡 靜，許建明，梅 俏

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點實驗室,安徽 合肥 230022)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是由免疫調(diào)節(jié)功能紊亂介導(dǎo)的慢性腸道炎癥性病變，發(fā)病機制尚不十分清楚，可能與腸道環(huán)境因素、腸上皮屏障和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)之間的異常相互作用有關(guān)[1]。在免疫調(diào)節(jié)紊亂的過程中，巨噬細胞分泌大量炎癥細胞因子和趨化因子，包括IL-1、IL-6、TNF-α等，進一步加劇結(jié)腸的炎性損傷程度。巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞，通過模式識別受體，識別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，引發(fā)固有免疫反應(yīng)，快速有效對抗病原體[2]。IBD患者腸道中巨噬細胞數(shù)量明顯增加，研究表明，自噬在固有免疫反應(yīng)中起著重要作用，可以有效減輕結(jié)腸炎中過度炎癥和免疫反應(yīng)[3]。自噬是一種細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制，包括形成吞噬泡，延長并吞噬細胞溶質(zhì)成分(包括細胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體和病原體)，形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，與溶酶體融合后溶質(zhì)成分降解和再循環(huán)[4]。自噬受損被認為參與IBD發(fā)生機制。自噬缺陷導(dǎo)致腸壁內(nèi)固有免疫反應(yīng)增強和促炎細胞因子產(chǎn)生明顯增加，提示IBD中固有免疫反應(yīng)與巨噬細胞自噬密切相關(guān)[5]。

Kv1.3通道通過調(diào)節(jié)Ca2+信號傳導(dǎo)，控制巨噬細胞的活化和增殖過程。同時， Ishii等[6]研究表明，Kv1.3與p62密切相關(guān)。p62是一種重要的自噬相關(guān)蛋白，在自噬中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。特異性Kv1.3阻滯劑對巨噬細胞的調(diào)控作用可能發(fā)揮治療免疫功能紊亂有關(guān)的炎癥性疾病。5-(4-苯氧基丁氧基)補骨脂素[5-(4-phenoxybutoxy)psoralen，PAP-1]是一種新型特異性小分子Kv1.3通道阻滯劑[7]。本實驗通過探討Kv1.3阻滯劑PAP-1對葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulphate，DSS)結(jié)腸炎的作用及相關(guān)機制,為IBD治療藥物研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠,♂,體質(zhì)量(20±2)g,購于安徽省實驗動物中心, 動物質(zhì)量合格證編號：34000200001278。

1.2 試劑DSS(分子質(zhì)量40 000)、PAP-1(P6124)，均購自Sigma公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒、糞便隱血試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；cDNA合成試劑盒，購自美國Thermo Scientific公司；QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒，購自德國Hilden Qiagen公司；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒，均購自武漢新啟迪生物科技有限公司；抗p62、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、IL-1β抗體，均購于北京博奧森生物有限公司；抗Beclin-1、LC3-Ⅱ、Kv1.3、F4/80抗體，均購于Abcam公司。

1.3 儀器高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；Elx800型酶標儀(美國Bio-Tek公司)；EPS 300型電泳儀(上海天能科技有限公司)；K960型PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；PikoReal 96型熒光定量PCR儀(Thermo Scientific公司)。

2 方法

2.1 模型的制備與實驗分組將40只小鼠隨機分成4組。A組:正常對照組，正常飲水和腹腔注射等體積溶劑(含3% DMSO的生理鹽水)；B組:正常對照+PAP-1注射組，正常飲水和腹腔注射PAP-1(3 μg·g-1,每天3次)；C組:DSS模型組，飲用含5% DSS的水和腹腔注射等體積溶劑(含3% DMSO的生理鹽水)；D組:DSS模型+PAP-1注射組，飲用含5% DSS的水和腹腔注射PAP-1(3 μg·g-1,每天3次)。實驗造模連續(xù)7 d。實驗結(jié)束時處死所有小鼠，按文獻方法制備小鼠腹腔巨噬細胞及脾臟巨噬細胞，同時收集小鼠結(jié)腸組織待測。

2.2 結(jié)腸炎嚴重程度評價實驗每日記錄小鼠體質(zhì)量、便血情況和糞便性狀。采用隱血試劑盒測定糞便潛血。計算小鼠疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分[8]。實驗結(jié)束時，取出小鼠結(jié)腸組織，10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋，切片厚約4 μm，HE染色，進行病理組織學(xué)指數(shù)(histological index，HI)評分[9]。

2.3 結(jié)腸勻漿MPO活性及細胞因子水平檢測用生理鹽水制備10%結(jié)腸組織勻漿。按說明書操作,檢測小鼠結(jié)腸組織勻漿MPO活性，以及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α水平。

2.4 免疫熒光染色檢測結(jié)腸巨噬細胞的滲出石蠟切片經(jīng)脫蠟及水化，2%過氧化氫抗原修復(fù)，3% BSA封閉，F(xiàn)4/80一抗(1 ∶100)4 ℃溫育過夜，與二抗室溫避光孵育1 h，DAPI浸染細胞核，封片。共聚焦激光掃描顯微鏡觀察圖像并進行分析。

2.5 腹腔和脾臟巨噬細胞的分離提取參照文獻方法[10]，收集小鼠腹膜巨噬細胞。用8 mL冷PBS溶液沖洗小鼠腹腔5 min,收集腹腔灌洗液。離心獲取細胞，接種在含有RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青-鏈霉素)的12孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2 h。用PBS充分洗滌，除去非貼壁細胞，收集黏附細胞即為腹腔巨噬細胞。

將小鼠脾臟組織切成小塊，輕研磨通過200目的鋼絲網(wǎng)，獲得脾細胞懸浮液。按上述方法，從脾細胞懸浮液中獲取脾臟巨噬細胞。

2.6 透射電鏡觀察巨噬細胞內(nèi)自噬體將小鼠腹腔和脾臟巨噬細胞制備成細胞團塊。2.5%戊二醛4 ℃固定過夜。用1%鋨酸固定，并用不同濃度的乙醇脫水，環(huán)氧樹脂固定，70 nm切片，JEM-1230F電子顯微鏡觀察巨噬細胞內(nèi)自噬體。

2.7 qPCR檢測小鼠結(jié)腸組織和巨噬細胞中iNOS、IL-1β及自噬相關(guān)基因mRNA的表達取小鼠腹腔和脾臟巨噬細胞和結(jié)腸組織，采用TRIzol試劑提取RNA。按RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒，擴增獲得cDNA用于定量PCR。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s,共35個循環(huán)。繪制擴增曲線及熔解曲線，以β-actin基因為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences of qPCR

2.8 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織和巨噬細胞中iNOS、IL-1β及自噬相關(guān)蛋白的表達取小鼠腹腔和脾臟巨噬細胞和結(jié)腸組織，采用細胞裂解液提取蛋白質(zhì),SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。脫脂乳室溫封閉2 h。將膜與一抗IL-1β、iNOS、p62、Beclin-1、LC3-II、β-actin 4 ℃孵育過夜。加入TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育2 h。再次加入TBST洗滌3次，以β-actin為內(nèi)參，采用ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 PAP-1減輕結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥與正常組比較，模型組結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量逐漸減輕，PAP-1降低結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕趨勢(Fig 1A)。模型組DAI評分明顯高于正常組,PAP-1組DAI評分低于模型組(Fig 1B)。Fig 1C、1D結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組結(jié)腸黏膜病理顯示結(jié)腸損傷明顯，有明顯上皮細胞破壞，大量的炎細胞浸潤，杯狀細胞丟失和黏膜下層水腫，HI評分及結(jié)腸勻漿MPO活性增高(P<0.05)；與模型組比較，PAP-1組結(jié)腸黏膜病理損傷減輕，HI評分和結(jié)腸勻漿MPO活性降低(P<0.05)。

Fig 1 Effects of PAP-1 on DSS-induced colitic

A: The daily mean weight change in each group; B: The changes of DAI in each group daily; C: The colonic HI scoring and MPO activity in each group; D: Histopathological features of the colon in each group (HE×400).#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

Fig 2 Effects of PAP-1 on inflammatory cytokine production of colon tissues in DSS-induced colitic mice

3.2 PAP-1對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥因子水平的影響如Fig 2所示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1、IL-6和TNF-α含量上升(P<0.05),IL-10含量下降(P<0.05)，IL-1β mRNA和蛋白的表達增強(P<0.05)。與模型組比較，PAP-1組小鼠結(jié)腸組織中IL-1、IL-6和TNF-α含量均下降(P<0.05),IL-10含量上升(P<0.05)，IL-1β mRNA和蛋白的表達減弱(P<0.05)。

3.3 PAP-1減少結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸巨噬細胞滲出和活化Fig 3A的免疫熒光染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中總巨噬細胞標記物F4/80的表達增加，經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中F4/80的表達少于模型組，表明PAP-1可減少小鼠結(jié)腸組織中巨噬細胞的滲出。采用iNOS作為巨噬細胞激活的標志，F(xiàn)ig 3B結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸組織中iNOS mRNA和蛋白的表達較正常組明顯增強, PAP-1組小鼠結(jié)腸組織中iNOS mRNA和蛋白的表達較模型組減弱,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示PAP-1可能減少結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中巨噬細胞的激活。

3.4 PAP-1對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸自噬的影響Fig 4結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達降低, p62 mRNA和蛋白表達增加；經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達增加，p62 mRNA和蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 3 Colonic macrophage infiltration and activation in colitic mice reduced by PAP-1

3.5 PAP-1對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腹腔巨噬細胞自噬的影響Fig 5的透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)自噬體減少，PAP-1組小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)自噬體較模型組增多。Fig 6結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達降低,iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達增加；經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠腹腔巨噬細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達增加，iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.6 PAP-1對結(jié)腸炎小鼠脾臟巨噬細胞自噬的影響Fig 7的透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脾臟巨噬細胞內(nèi)自噬體減少，PAP-1組小鼠脾臟巨噬細胞內(nèi)自噬體較模型組增多。Fig 8結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脾臟巨噬細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達降低, iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達增加；經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠脾巨噬細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達增加，iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 Effect of PAP-1 on colon autophagy

A: Effect of PAP-1 on the expression levels of colonic LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 mRNA in colitic mice; B: Effect of PAP-1 on the expression levels of colonic LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 proteins in colitic mice.#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

Fig 5 Effect of PAP-1 on autophagy-related structure of peritoneal macrophages observed by electron microscopy

A: Normal; B: PAP-1; C: Model; D: DSS+PAP-1. The yellow arrows represent autophagic vacuoles.

Fig 6 Effect of PAP-1 on iNOS, IL-1β and autophagy in peritoneal macrophages of colitic

A: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 mRNA in peritoneal macrophages of colitic mice; B: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 proteins in peritoneal macrophages of colitic mice.#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

Fig 7 Effect of PAP-1 on autophagy-related structure of spleen macrophages observed by electron microscopy

A: Normal; B: PAP-1; C: Model; D: DSS+PAP-1. The yellow arrows represent the autophagic vacuoles.

Fig 8 Effect of PAP-1 on iNOS, IL-1β and autophagy in spleen macrophages of colitic

A: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 mRNA in spleen macrophages of colitic mice; B: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 proteins in spleen macrophages of colitic mice.#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

4 討論

IBD是一種以免疫功能紊亂為特征的腸道難治性炎性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥黏膜中有大量活化的巨噬細胞浸潤，巨噬細胞可分泌大量促炎細胞因子和趨化因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α等，促進腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生,部分藥物通過調(diào)節(jié)巨噬細胞功能可以減輕小鼠結(jié)腸炎[2]。本研究顯示，DSS結(jié)腸炎小鼠中結(jié)腸巨噬細胞滲出增加。iNOS是巨噬細胞活化的主要標志物。結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸和巨噬細胞中iNOS表達明顯增加，表明結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)巨噬細胞明顯活化。同時發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸和巨噬細胞中IL-1β表達均明顯增加，提示巨噬細胞在結(jié)腸炎發(fā)病機制中起重要作用。

研究表明，Kv通道通過調(diào)節(jié)巨噬細胞增殖和活化過程，在疾病免疫功能調(diào)控中起關(guān)鍵作用。Kv1.3通道是巨噬細胞中重要的離子通道,活化的巨噬細胞中Kv1.3表達明顯增加[9]。因此，阻斷Kv1.3通道，降低巨噬細胞活化，可能是調(diào)控結(jié)腸炎炎癥的有效方法。研究表明，抑制淋巴細胞和巨噬細胞中過表達的Kv1.3通道，可以抑制炎性細胞因子的合成，減緩?fù)砥诼阅I衰竭中腎纖維化過程，改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等具有巨噬細胞免疫功能紊亂的自身免疫炎癥性疾病[11]。Schmitz等[7]發(fā)現(xiàn)，PAP-1是一種特異性小分子Kv1.3阻斷劑，EC50為2 nmol·L-1，比Kv1.5選擇性高23倍,腹腔注射或口服PAP-1可預(yù)防遲發(fā)型過敏反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，PAP-1可降低DSS結(jié)腸炎小鼠DAI評分、HI評分、MPO活性及促炎細胞因子水平，升高抗炎細胞因子水平，減低結(jié)腸組織中巨噬細胞滲出及活化。提示PAP-1可降低巨噬細胞活化，減輕結(jié)腸炎小鼠的炎癥損傷。

研究表明，自噬與IBD發(fā)病機制相關(guān)，自噬相關(guān)基因如Atg1611、IRGM與IBD易感性有關(guān)，表明自噬可能影響IBD病理生理過程[12]。Hugot等[13]發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞自噬與腸道的固有免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。Lapaquette等[14]發(fā)現(xiàn)，黏附侵襲性大腸桿菌(AIEC)刺激，可引起自噬受損的巨噬細胞內(nèi)IL-6、TNF-α水平增加。Cabrera等[5]研究表明，Atg4b缺乏引起的自噬抑制，可增加DSS結(jié)腸炎的易感性,主要原因是促進結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織和腹腔巨噬細胞中促炎細胞因子的產(chǎn)生。提示IBD中巨噬細胞與自噬密切關(guān)系。Ke等[9]發(fā)現(xiàn)，在LPS/DSS刺激的腹腔巨噬細胞以及DSS結(jié)腸炎小鼠中，自噬可抑制NLRP3炎性體活化。因此，PAP-1阻斷Kv1.3通道，減輕結(jié)腸炎的相關(guān)機制可能與巨噬細胞自噬有關(guān)。

與有關(guān)研究結(jié)果相似[15]，本研究結(jié)果顯示，DSS結(jié)腸炎小鼠巨噬細胞和結(jié)腸組織中p62表達增加，Beclin-1、LC3-Ⅱ表達降低，同時巨噬細胞內(nèi)自噬泡減少，表明DSS結(jié)腸炎小鼠巨噬細胞和結(jié)腸組織自噬受到抑制。p62與LC3結(jié)合，將靶底物送至自噬體以降解,自噬受損時p62水平升高。Beclin-1是Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物的重要組成部分，參與自噬體形成。LC3-II參與自噬體膜的延伸及閉合,是監(jiān)測自噬水平的重要標準，其表達量與自噬體數(shù)量相關(guān)[4]。PAP-1可降低結(jié)腸炎小鼠巨噬細胞和結(jié)腸組織中p62表達，增加Beclin-1和LC3-Ⅱ表達,同時增加巨噬細胞內(nèi)自噬泡形成，表明PAP-1可降低DSS結(jié)腸炎小鼠巨噬細胞和結(jié)腸組織的自噬抑制，減輕巨噬細胞調(diào)節(jié)的結(jié)腸固有免疫炎癥反應(yīng)。

綜上所述，PAP-1可減輕DSS結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥損傷，減輕巨噬細胞和結(jié)腸組織自噬抑制，提示PAP-1促進自噬通路修復(fù)，調(diào)節(jié)巨噬細胞固有免疫功能。