陳健民，譚麗秋，蔣俊俊，梁冰玉，周 燕，

(廣西醫(yī)科大學(xué)1. 藥學(xué)院、2. 廣西艾滋病防治研究重點實驗室，廣西 南寧 530021)

趨化因子是細(xì)胞因子家族中的重要組成成員之一，根據(jù)其N末端半胱氨酸殘基的數(shù)量和排列不同，可進(jìn)一步將趨化因子分為4類，即C類、CC類、CXC類以及CX3C類。最初認(rèn)為趨化因子是免疫調(diào)節(jié)的重要參與者之一，具有募集、趨化免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部分并發(fā)揮免疫應(yīng)答的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中扮演著重要且多重的角色，其中，CC類趨化因子配體2(chemokine CC motif ligand 2, CCL2)作為趨化作用最強的因子之一，近年來備受關(guān)注。在CNS中，CCL2具有維持神經(jīng)元正?；钚?，并參與神經(jīng)元通訊交流等生理功能。然而，過表達(dá)的CCL2參與了如中風(fēng)、癲癇、神經(jīng)退行性疾病[1-3]等CNS疾病發(fā)生的病理生理過程。在腦部，CCL2主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞以及來源于外周并遷移至CNS的巨噬細(xì)胞等，也可產(chǎn)生CCL2[4]。這些細(xì)胞釋放的CCL2能通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、興奮毒性、氧化應(yīng)激等途徑損傷神經(jīng)元，并可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶力減退及認(rèn)知功能低下的臨床表現(xiàn)。研究人員在阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease, AD)、艾滋性認(rèn)知功能障礙(HIV-associated neurocognitive disorder, HAND)等患者的腦脊液中檢測到了高水平的CCL2，而這些患者均伴隨有不同程度的認(rèn)知功能障礙[5-6]，提示CCL2可能與認(rèn)知功能損害有關(guān)。但由于相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)和結(jié)論太少，導(dǎo)致對CCL2的致病機制還不是十分清楚。故本研究采用腦部立體定位技術(shù)，首次將CCL2注射至大鼠雙側(cè)海馬腦區(qū)，制備一種動物模型來研究CCL2對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機制。我們利用Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)檢測CCL2對大鼠的學(xué)習(xí)記憶的影響，實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測海馬組織中參與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-8、caspase-3 mRNA的表達(dá)水平，探討其誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的機制；RT-PCR法檢測各組大鼠海馬組織內(nèi)磷酸激活谷氨酰胺酶(phosphate-activated glutaminase, PAG))mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測各組大鼠海馬組織內(nèi)腫瘤壞死因子ɑ(tumor necrosis factorɑ, TNF-ɑ)、乙酰膽堿酯酶(cholinesterase, AChE)的含量以及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的活力，來探究其誘發(fā)神經(jīng)損傷的機制。該研究旨在探究CCL2對學(xué)習(xí)記憶的影響和機制，為后續(xù)的臨床治療提供研究基礎(chǔ)和治療見解。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組40只SPF級♂SD大鼠，體質(zhì)量(215±15)g，購自于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2014-0002，實驗動物使用許可證：SCXK桂2014-0003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予規(guī)律光照(9 ∶00～17 ∶00)，允許自由攝食飲水。SD大鼠隨機分為5組：空白對照組(control)、假手術(shù)組(sham)、CCL2(0.5、5、50 ng)組，每組8只。將CCL2先配成100 mg·L-1的母液，用時用無菌生理鹽水分別稀釋成0.1、1、10 mg·L-1，除空白對照組外，其余各組均進(jìn)行雙側(cè)海馬內(nèi)注射，每側(cè)注射體積為2.5 μL，假手術(shù)組給予等量無菌生理鹽水。

1.2 試劑與儀器CCL2(R&D systems，批號：279-MC/CF)；caspase-8、caspase-3、PAG、GAPDH引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；AxyPrep總RNA制備試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司，批號：07418KD1)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，批號：RR047A)；SYBR熒光染料擴增試劑盒(TaKaRa，批號：RR820A)；大鼠TNF-ɑ、GS、AChE酶聯(lián)免疫分析試劑盒(北京安迪華泰生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，批號：P0010S)。腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；10 μL Hamilton微量注射器(Hamilton公司，型號：701N)；Morris水迷宮實驗裝置及分析系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 模型制備配制1%的戊巴比妥鈉，按45 mg·kg-1劑量腹腔注射麻醉。待動物麻醉后，顱頂區(qū)常規(guī)備皮，碘伏消毒。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點，按AP=-3.7 mm、ML=±3.0 mm、DV=-3.0 mm的坐標(biāo)位置進(jìn)行海馬區(qū)注射，注射速度為0.3 μL·min-1，注射完成后停針5 min避免藥物外漏，隨后緩慢提針。注射完成后縫合皮膚，并注射青霉素(30萬單位·kg-1)防止感染。

1.4 Morris水迷宮實驗術(shù)后的d 3開始進(jìn)行Morris水迷宮實驗。水池直徑為160 cm，池壁分為NW、SW、SE、EN四個象限，每個象限水池壁的中心位置各放置1個不同形狀的標(biāo)志物，水溫控制在(22±1)℃，在SW象限中心的水面下2 cm處放置1個平臺。實驗由3部分組成：① 適應(yīng)階段：在正式實驗前1 d將大鼠放置水池中任意游60 s，目的是讓其適應(yīng)環(huán)境；② 定位航行實驗：該階段共進(jìn)行5 d，每天進(jìn)行4次，每次將大鼠從不同的象限放入水中，記錄每次從入水點到找到水下平臺的時間(即逃避潛伏期)、游泳速度及游泳路程。實驗記錄的總時長為90 s，若大鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺，則手動引導(dǎo)其到達(dá)平臺30 s，此次的逃避潛伏期記為90 s。③ 空間探索實驗：該階段在定位航行實驗結(jié)束后的24 h進(jìn)行，在本實驗中撤去水下平臺，將大鼠從任一象限放入水中，記錄其在90 s內(nèi)在原平臺所在象限的路程百分比及原平臺穿越次數(shù)。

1.5 qPCR檢測caspase-8、caspase-3、PAG mRNA的表達(dá)Morris水迷宮實驗結(jié)束后，于d 10分離各組大鼠海馬組織，按柱式RNA提取試劑盒的說明提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按擴增試劑盒的說明對目的基因進(jìn)行擴增，獲得目的基因的擴增曲線和熔解曲線，記錄各基因的Ct值，GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列見Tab 1。結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

Tab 1 Primer sequence of target genes

1.6 ELISA法檢測海馬組織內(nèi)TNF-α、AChE的含量以及GS的活力將各組大鼠于冰上迅速斷頭取腦，分離海馬組織，并制備10%的海馬勻漿，BCA法檢測各樣本蛋白總濃度，TNF-α、AChE的含量檢測以及GS的活力檢測按照相關(guān)試劑盒的說明操作。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠游泳速度、逃避潛伏期和游泳路程的結(jié)果比較Tab 2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，在各組大鼠游泳速度無明顯差異的前提下，各CCL2處理組大鼠的逃避潛伏期及游泳路程均明顯增長，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。d 5各組大鼠的游泳軌跡見Fig 1。

2.2 各組大鼠原平臺穿越次數(shù)、原平臺所在象限路程百分比結(jié)果Tab 3結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，各CCL2處理組大鼠原平臺穿越次數(shù)及原平臺所在象限的路程百分比均明顯減少，并呈現(xiàn)劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 海馬組織內(nèi)caspase-8、caspase-3、PAG mRNA的表達(dá)結(jié)果如Fig 2所示，與假手術(shù)組相比，各CCL2處理組大鼠海馬組織內(nèi)caspase-8 mRNA的相對表達(dá)有升高趨勢，結(jié)果呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，50 ng CCL2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量均有升高趨勢，結(jié)果呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PAG mRNA的相對表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系增加，50 ng CCL2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 Typical swim-tracking path in probe trial on 5th training day

A:Control; B: Sham; C: 0.5 ng CCL2; D:5 ng CCL2; E: 50 ng CCL2.

Tab 2 Results of swimming speed, escape time and swimming distance of each

*P<0.05,**P<0.01vssham

Tab 3 Results of crossing times, percentage of distance spent in target quadrant of each

*P<0.05,**P<0.01vssham

2.4 海馬組織內(nèi)TNF-α、AChE的含量以及GS的活性檢測如Fig 3所示，與假手術(shù)組相比，各CCL2處理組大鼠海馬組織內(nèi)TNF-α、AChE含量均升高，50 ng CCL2組結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；GS的活力均降低，5、50 ng CCL2組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

CCL2又被稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，是CC趨化家族的重要成員，是目前已知的趨化作用最強的細(xì)胞因子之一，在顱腦創(chuàng)傷、多發(fā)性硬化癥，腦缺血等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，CCL2主要與CC類趨化因子受體2(CCR2)結(jié)合，并募集單核細(xì)胞到達(dá)特定部位，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。CCL2-CCR2軸在老年癡呆、艾滋性癡呆以及帕金森病患者表現(xiàn)出的抑郁癥等疾病的病理生理過程中扮演了重要的角色，研究人員從這些患者的腦脊液中檢測到了高表達(dá)的CCL2以及CCR2，而這些患者通常伴有不同程度的認(rèn)知功能障礙，說明CCL2可能影響患者的學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知能力以及情緒活動[5,10-11]，但其具體的作用和機制仍不是十分明確。因此，本研究首次將不同劑量的CCL2注射至大鼠雙側(cè)海馬腦區(qū)制備動物模型，來研究CCL2對學(xué)習(xí)記憶的影響及其機制。我們利用Morris水迷宮實驗檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，探究CCL2對大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的影響。經(jīng)典的Morris水迷宮實驗由定位航行實驗和空間探索實驗兩部分組成，前者著重檢測嚙齒動物的學(xué)習(xí)能力，后者主要用于檢測動物記憶的維持能力。本研究結(jié)果表明，在各組大鼠游泳速度無明顯差異的前提下，不同劑量的CCL2均能明顯延長大鼠的逃避潛伏期，增加游泳路程，且結(jié)果呈劑量依賴性關(guān)系，表明CCL2能夠損傷大鼠的學(xué)習(xí)能力。在空間探索實驗中，不同劑量的CCL2均能明顯減少平臺的穿越次數(shù)以及原平臺所在象限的路程百分比，表明各模型組大鼠的空間記憶受到不同程度的損害，且呈劑量依賴性關(guān)系。提示CCL2能劑量依賴性地?fù)p傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外，臨床研究也發(fā)現(xiàn)，患者出現(xiàn)認(rèn)知障礙的程度與腦脊液中CCL2表達(dá)水平呈正相關(guān)。

Fig 2 The relative expression of caspase-8, caspase-3 and PAG mRNA in rat

*P<0.05,**P<0.01vssham

Fig 3 Expression of TNF-α, AChE and activity of

*P<0.05,**P<0.01vssham

上述行為學(xué)實驗已經(jīng)表明，CCL2能損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能，而膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮了重要的作用，在阿爾茨海默癥患者中能觀察到膽堿能神經(jīng)元的丟失，而高表達(dá)的AChE能水解ACh，降低ACh的含量，從而降低患者的學(xué)習(xí)記憶能力。故我們進(jìn)一步檢測了大鼠海馬組織內(nèi)AChE的表達(dá)，探究CCL2是否能影響ACh的水平。結(jié)果表明，各模型組大鼠海馬組織內(nèi)AChE的活性升高，表明CCL2可通過升高AChE，減少ACh的含量，降低大鼠的學(xué)習(xí)記憶力。

中樞神經(jīng)炎癥和興奮性毒性是CNS疾病發(fā)病過程涉及的兩大機制。CCL2的促炎癥反應(yīng)已經(jīng)是公認(rèn)的事實，CCL2作為一種促炎性趨化因子，能誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，放大炎癥反應(yīng)并損傷組織細(xì)胞。在本研究中，我們檢測了各組大鼠海馬組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)，結(jié)果證明0.5～50 ng的CCL2能增加TNF-α的水平，且該效應(yīng)呈劑量依賴關(guān)系，表明CCL2能誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

CNS的興奮性在突觸傳遞中具有重要意義，谷氨酸是腦內(nèi)重要的興奮性氨基酸，通過激活突觸后膜上的NMDA受體，增強長時程增強效應(yīng)(long-term potentiation，LTP)，而該效應(yīng)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶重要的分子機制之一。但是，突觸間隙過多累積的谷氨酸能過度激活NMDA受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，并由此引發(fā)細(xì)胞凋亡，因此，神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮會導(dǎo)致興奮性毒性的發(fā)生。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，CCL2不僅僅是增強NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current，EPSC)，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流增加，并且還能導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，并引起神經(jīng)元死亡，表明CCL2介導(dǎo)突觸傳遞的增強過程與興奮毒性有關(guān)。故我們進(jìn)一步猜測CCL2與谷氨酸的生成有關(guān)。在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中存在一個谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)，其中GS和PAG是該循環(huán)中具有重要調(diào)節(jié)作用的兩種酶。GS能將攝入到膠質(zhì)細(xì)胞中的谷氨酸變成谷氨酰胺，降低谷氨酸的水平，而PAG則能使谷氨酰胺脫氨基生成谷氨酸，從而提高谷氨酸的水平。故我們檢測了上述兩種酶的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，CCL2能降低GS的活力，同時上調(diào)PAG的表達(dá)，這兩種效應(yīng)的綜合結(jié)果使得谷氨酸的合成增加。我們前期研究結(jié)果表明，CCL2能增加NMDA受體介導(dǎo)的EPSC幅度，在給予NMDA受體阻斷劑后，其幅度明顯下降，而谷氨酸具有激活NMDA受體的作用。因此，我們認(rèn)為CCL2促進(jìn)神經(jīng)興奮毒性發(fā)生的機制可能與增加谷氨酸在神經(jīng)突觸間隙的濃度，并過度興奮NMDA受體有關(guān)。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)CCL2參與了炎癥反應(yīng)和興奮性毒性的發(fā)生。這些傷害性刺激往往能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，且神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致神經(jīng)元丟失應(yīng)該是引起學(xué)習(xí)記憶力下降的證據(jù)之一。細(xì)胞凋亡是機體內(nèi)清除老化、壞死的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的程序性細(xì)胞死亡過程，對于保證機體的正常生理功能具有重要意義。然而，在如炎癥、興奮性毒性引起的Ca2+超載、氧化應(yīng)激等條件的刺激下，導(dǎo)致凋亡異常發(fā)生，進(jìn)而參與腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病等疾病的病理生理過程。細(xì)胞凋亡途徑分為caspase依賴性途徑和非caspase依賴性途徑，前者主要由caspase分子執(zhí)行，又主要分為兩類：①線粒體通路，由線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c釋放至胞質(zhì)中，并切割caspase-9前體，激活caspase-9啟動凋亡程序，該通路又被稱為內(nèi)源性途徑。②外源性通路，也被稱為死亡受體通路，即Fas/FasL通路，由FasL與Fas結(jié)合并活化caspase-8啟動級聯(lián)反應(yīng)。死亡受體隸屬于腫瘤壞死因子受體超家族，因此，TNF-ɑ能激活神經(jīng)元細(xì)胞膜上的死亡結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而引起caspase級聯(lián)效應(yīng)，此外，興奮性毒性也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。前已述及CCL2能促進(jìn)TNF-ɑ和谷氨酸的表達(dá)，故本研究進(jìn)一步檢測了參與外源性凋亡途徑中caspase-8、caspase-3的相對表達(dá)，將炎癥反應(yīng)、興奮性毒性與外源性凋亡途徑聯(lián)系起來，探討CCL2誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的機制。實驗結(jié)果表明，各劑量CCL2能夠以劑量依賴性關(guān)系上調(diào)海馬組織內(nèi)caspase-8、caspae-3 mRNA的相對表達(dá)，尤其是高劑量CCL2對caspase-8 mRNA相對表達(dá)的上調(diào)作用明顯，證明CCL2可通過外源性細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在行為學(xué)實驗中，0.5～50 ng的CCL2劑量依賴性地?fù)p傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并有以下幾個方面作用：① 通過促進(jìn)TNF-α表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；② 通過上調(diào)PAG表達(dá)，抑制GS活性，并促進(jìn)EPSCNMDAR的幅度，介導(dǎo)神經(jīng)興奮毒性的發(fā)生；③ 通過上調(diào)AChE的表達(dá)，水解ACh，降低ACh的含量；④ 可活化caspase-8依賴的外源性細(xì)胞凋亡途徑，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。由此可以得出結(jié)論，0.5～50 ng的CCL2能劑量依賴性損傷學(xué)習(xí)記憶力，其機制和腦組織炎癥反應(yīng)、神經(jīng)興奮毒性及ACh含量下降有關(guān)，并最終誘導(dǎo)caspase-8依賴的外源性細(xì)胞凋亡途徑，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

(致謝：本文中水迷宮實驗在廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院完成，ELISA、RT-PCR在廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心細(xì)胞與免疫實驗室完成。感謝各位老師和同學(xué)給予的幫助。)