吳相枝，徐銘枝，張東偉，付 潔，王 伊，宋海峰

(1. 安徽醫(yī)科大學，安徽 合肥 230032；2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所，特殊環(huán)境組學研究室，蛋白質藥物國家工程研究中心，北京 102206)

小膠質細胞是位于中樞神經系統(central nervous system，CNS)的固有免疫細胞，約占中樞神經系統總細胞數的10%～12%，在神經保護和神經損傷中起到重要作用[1-2]。一方面，它起到免疫監(jiān)視和趨化作用，構成CNS特有的免疫系統[3]。另一方面，多種CNS疾病都與非正常激活狀態(tài)的小膠質細胞相關，包括腦卒中、阿爾茨海默癥、帕金森病等[4]。

原代與永生化的小膠質細胞是研究神經系統疾病的常用工具。從數量、均一性、獲得的難易程度等考慮，永生化的小膠質細胞優(yōu)于原代細胞，但永生化細胞在連續(xù)的傳代培養(yǎng)中，可能失去某些重要的特征和功能[5-6]。因此，原代膠質細胞的生物學相關性更好，更貼近體內真實情況[7]。故原代膠質細胞的體外培養(yǎng)在相關疾病機制研究以及新藥研發(fā)中具有不可替代的作用[7]。膠質細胞炎癥反應模型是CNS藥理學研究的重要體外模型，對CNS相關疾病的新藥發(fā)現至關重要[7-8]。自初次獲得原代小膠質細胞以來，其提純與培養(yǎng)技術早已成熟固化[5]。雖然D-型多聚賴氨酸(poly-D-lysine，PDL)存在細胞毒性問題，但在膠質細胞培養(yǎng)中仍廣泛使用[5-11]。近年來，在細胞外基質包被技術[12-13]、炎癥因子定量檢測技術[14]、細胞共培養(yǎng)與協同性研究技術等方面，都有了新的突破[15]。在新材料、新技術得到廣泛應用的背景下，我們有必要重新審視固化多年的原代膠質細胞分離培養(yǎng)技術[11-16]。本研究將新型包被材料(Matrigel、膠原蛋白)與傳統的小膠質細胞包被材料(PDL)進行比較，并利用多因子檢測技術對細胞炎癥反應進行全面的定量評價。分析了多種影響原代膠質細胞炎癥模型的因素，從多個新的角度為未來中樞神經系統細胞炎癥模型的建立提供指引，并提出了優(yōu)化后的技術建議。

1 材料

1.1 試劑胎牛血清、高糖DMEM、胰酶、Hank′s緩沖液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、抗生素(美國Gibco公司)；PDL溶液(碧云天, C0312)；I型膠原蛋白 (collagen I, Solarbio公司, C8062)；Matrigel (美國Coring, 356234)；RNA提取試劑盒(德國QIAGEN, 74106)；反轉錄試劑盒(美國Bio-Rad, 1708891)；qPCR熒光染料 (諾維贊, Q321-03)；ICC用抗Iba1抗體(日本Wako, 019-19741)；抗GFAP(ab4674)抗體、雞IgY、polyclonal-Isotype Control(ab37382)、抗Tuj1抗體(ab18207)、兔IgG、polyclonal-Isotype Control(ab171870)、抗Iba1抗體[1022-5](FITC) (ab15691)、小鼠IgG2b[PLPV219](FITC)-Isotype Control(ab91368)，均購自英國Abcam公司；Alexa Fluor?488 AffiniPure羊抗兔IgG(H+L)(翊圣生物, 33106ES60)；Alexa Fluor?647 AffiniPure羊抗雞IgY(IgG)(H+L)(美國Jackson, 103605155)；熒光法吞噬檢測試劑盒(美國AAT-Biolite)。

1.2 儀器細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司)；qPCR儀(美國Bio-Rad)；體視鏡(北京福凱儀器有限公司)；倒置顯微鏡 (日本Olympus)；流式細胞儀(美國BD)；Incucyte S3活細胞動態(tài)成像與分析系統(美國Essen BioScience)。

1.3 實驗動物新生24 h內的C57BL/6J乳鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司生產[SCXK (京)2016-0006]，不區(qū)分♀♂。

2 方法

2.1 培養(yǎng)材料表面處理用PBS稀釋PDL溶液至終濃度為0.1 g·L-1，包被24孔板和75 cm2培養(yǎng)瓶，室溫靜置15 min。使用前，PBS清洗2次。Matrigel、I型膠原蛋白包被方式按說明書使用。

2.2 細胞懸液制備及培養(yǎng)新生24 h內的C57BL/6J小鼠乳鼠CO2吸入處死后，取下頭部置于Hank′s緩沖液中，在體視鏡下去除腦膜，僅保留雙側大腦半球。去膜后的腦放入含0.1% BSA DMEM培養(yǎng)基中；1 500 r·min-1離心5 min；加入培養(yǎng)基將組織吹碎，用70 μm細胞篩過濾后，再次離心。重懸后的細胞接種至PDL包被、未包被的75 cm2培養(yǎng)瓶，以及PDL包被的60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。并取出部分留樣(d 0)。

2.3 混合膠質細胞的制備培養(yǎng)皿中細胞分別培養(yǎng)2、4、7 d。75 cm2培養(yǎng)瓶中的細胞，培養(yǎng)9 d和14 d，用0.05%胰酶消化8 min，收集細胞，離心獲得混合膠質細胞沉淀。

2.4 小膠質細胞的制備利用美天旎CD11b磁珠分選混合膠質細胞，獲得CD11b陽性的小膠質細胞。

2.5 實時熒光定量PCR檢測培養(yǎng)9 d的混合膠質細胞及小膠質細胞，分別接種至PDL包被和未包被的24孔板中培養(yǎng)過夜，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的LPS(10、100、1 000 μg·L-1)處理48 h。提取培養(yǎng)0、2、4、6、7 d的混合細胞的總RNA及上述樣品的總RNA。反轉錄獲得cDNA。采用染料法進行qPCR檢測，以管家基因RPL27為內參，檢測混合膠質細胞的Tuj1、NeuN、TREM2的mRNA轉錄水平和LPS刺激組樣品檢測IL-1α、IL-1β的mRNA水平。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Real-time PCR primer sequence

2.6 免疫熒光實驗小膠質細胞接種至12孔板中培養(yǎng)過夜，加入4%多聚甲醛固定20 min；用PBS清洗2次，加入5%山羊血清封閉30 min；用PBS清洗2次，加入1 μL抗Iba1和0.5 μL抗GFAP抗體4 ℃孵育過夜；PBS清洗3次，加入0.5 μL Alexa Fluor?488、1 μL Alexa Fluor?647標記的二抗，室溫孵育1 h；PBS清洗3次，加入DAPI室溫孵育10～15 min，倒置顯微鏡觀察。

2.7 流式細胞術檢測混合膠質細胞和小膠質細胞利用80%甲醇固定5 min，0.1% Triton X-100處理20 min。分別加入GFAP、Tuj1、Iba1抗體，具體方法參照抗體說明書。流式細胞儀檢測混合細胞中星形膠質細胞、神經元及小膠質細胞所占的比例。

2.8 吞噬試驗原代小膠質細胞接種至未包被的96孔板中培養(yǎng)，對照組加入細胞松弛素D孵育30 min，隨后與實驗組細胞同時加入pH熒光探針Protonex×600 Red-Latex Beads Conjugate孵育4 h。利用Incucyte每隔20 min拍照1次，記錄熒光強度的變化，并將熒光強度均值與時間做歸一化處理。

2.9 液相芯片多因子檢測將混合膠質細胞和小膠質細胞對應接種至未包被、PDL包被、Matrigel包被以及I型膠原蛋白包被的24孔板中，無血清培養(yǎng)過夜后，加入100 μg·L-1LPS處理48 h，收集細胞上清，通過上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司進行多因子檢測。

2.10 統計學分析數據使用GraphPad Prism 6軟件分析，多樣本均數比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性采用Fisher檢驗，方差不齊則采用T檢驗法。

3 結果

3.1 膠質細胞表征

3.1.1qPCR表征混合細胞中各類細胞特征性標記物mRNA相對轉錄水平隨時間的變化 混合細胞在培養(yǎng)0、2、4、6、7 d后，檢測各類細胞特征性標記物mRNA的相對轉錄水平。如Fig 1所示，在培養(yǎng)至d 2時，神經元特異性標記物Tuj1、NEUN mRNA轉錄水平迅速降低，說明神經元細胞數量迅速減少(Fig 1A)。而小膠質細胞特征性標記物TREM2和星形膠質細胞標記物GFAP的mRNA轉錄水平，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，且GFAP mRNA轉錄水平上升速度遠高于TREM2。小膠質細胞培養(yǎng)至d 6時，TREM2的轉錄水平上調31倍，趨于穩(wěn)定(Fig 1B)。

Fig 1 Relative transcription levels of GFAP, TREM2, Tuj1 and NEUN

Normalization by RPL27.

3.1.2免疫熒光表征小膠質細胞純度 小膠質細胞用多聚甲醛固定后，加入抗GFAP、Iba1兩種單克隆抗體、熒光染料DAPI進行免疫熒光實驗。結果顯示，全部細胞均標記上綠色熒光，鏡下未見紅色熒光標記的細胞(Fig 2)。說明磁珠分選獲得了高純度的小膠質細胞。

Fig 2 Immunofluorescence staining of microglia obtained by magnetic bead sorting(×10)

Blue is DAPI-stained nuclei, green is Iba1-FITC-stained microglia, and red is GFAP-stained astrocytes.

3.1.3流式細胞術檢測混合膠質細胞中各細胞所占的比例 如Fig 3所示，星形膠質細胞(GFAP+)占混合細胞的91.4%，神經元細胞(Tuj1+)未檢出，小膠質細胞(Iba1+)約占混合膠質細胞的8.5%。

Fig 3 Flow cytometric analysis of GFAP(A), Tuj1(B), Iba1(C) expression and proportion on primary mix glial cells

The cells were stained with anti-GFAP, anti-Tuj1, anti-Iba1 and their isotype control.

3.1.4小膠質細胞吞噬功能檢測 每組熒光強度隨時間的變化如Fig 4所示，對照組熒光強度不隨時間延長而增加；實驗組熒光強度隨時間的延長逐漸增強。說明獲得的原代小膠質細胞保留了正常小膠質細胞的吞噬能力。

Fig 4 Relationship between fluorescence intensity and time

Primary microglia were incubated with ProtonexTM600Red Beads for 4 h, fluorescence was processed by incucyte.

3.2 包被條件對膠質細胞炎癥模型評價的影響

3.2.1mRNA水平初步探究包被條件對膠質細胞炎癥模型評價的影響 為探究培養(yǎng)材料表面處理以及細胞間協同作用對膠質細胞炎癥反應的影響，將混合膠質細胞和小膠質細胞分別接種至未包被和PDL包被的培養(yǎng)材料中，加入含不同濃度LPS的培養(yǎng)液處理48 h，利用qPCR檢測IL-1α、IL-1β的mRNA變化情況。

3.2.1.1包被條件對混合膠質細胞的影響 考察不同包被條件對混合膠質細胞炎癥模型評價的影響。如Fig 5所示，加入LPS(100 μg·L-1)處理時，未包被條件下IL-1α的mRNA轉錄水平上調556倍，IL-1β的mRNA轉錄水平上調12倍，均明顯低于PDL包被條件下這兩種炎癥因子的轉錄水平。根據不同濃度LPS處理的結果可看出，培養(yǎng)材料是否包被，對膠質細胞炎癥反應影響較大，在包被條件下，混合膠質細胞對LPS更加敏感。

Fig 5 Transcription levels of inflammatory factor IL-1α and IL-1β mRNA after stimulation of mix glial by different concentrations of

**P<0.01vsuncoated condition

3.2.1.2包被條件對小膠質細胞炎癥模型評價的影響 如Fig 6所示，LPS(100 μg·L-1) 處理小膠質細胞，未包被條件下，IL-1α上調58倍，IL-1β上調11倍；包被條件下IL-1α上調34倍，IL-1β上調5倍。1 000 μg·L-1處理時，亦是未包被條件下經LPS刺激后，IL-1α和IL-1β轉錄水平相對于包被條件下的轉錄水平更高。綜上所述，未包被條件下，小膠質細胞對LPS更加敏感。

Fig 6 Transcription levels of inflammatory factor IL-1α and IL-1β mRNA after stimulation of microglial by different concentrations of

*P<0.05,**P<0.01vsuncoated condition

3.2.2深入探究包被條件對膠質細胞炎癥模型評價的影響 根據qPCR結果，選用100 μg·L-1LPS處理在多種培養(yǎng)材料表面培養(yǎng)的混合膠質細胞和小膠質細胞48 h，并收集細胞上清，使用液相芯片檢測樣品中G-CSF、IL-1α，IL-1β等23種細胞因子的含量?；旌夏z質細胞結果見Tab 2，小膠質細胞結果見Tab 3。

3.2.2.1包被條件對混合膠質細胞形態(tài)與生長的影響 混合膠質細胞培養(yǎng)在未包被、Matrigel包被、PDL包被、Ⅰ型膠原蛋白包被條件下的24孔板中，正常培養(yǎng)48 h，PDL包被和I型膠原蛋白包被條件下培養(yǎng)的混合膠質細胞無顯著形態(tài)差異，均與未包被條件下細胞形態(tài)類似(Fig 7A)。Matrigel包被條件下，小膠質細胞豐度明顯高于其他環(huán)境培養(yǎng)的小膠質細胞(Fig 7B)。加入LPS處理后，未包被條件下，細胞形態(tài)如Fig 7C所示，Matrigel包被條件下細胞形態(tài)如Fig 7D所示，與正常培養(yǎng)條件下相比較，表層的小膠質細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化。

3.2.2.2包被條件對混合膠質細胞炎癥模型評價的影響 在各種培養(yǎng)條件下，多因子檢測各炎癥因子濃度如Tab 3所示?？煽闯黾毎蜃覶NF-α、G-CSF、IL-1α、MIP-IL-1β、RANTES的表達量在Matrigel包被條件下明顯高于其他條件下，約為其他條件下的1.5～4倍；KC的表達量在Matrigel包被條件下是其他條件的8.5～20倍。GM-CSF的表達量在PDL包被條件下相對較低，而在其他三種條件下的表達量則差異無顯著性。其他細胞因子在各種條件下表達量差異均無顯著性。

Tab 2 Detection of mixed glial protein expression under different

OO>:out of high limit of detection, OO<: below low limit of detection

Tab 3 Detection of microglia protein expression under different

3.2.2.3包被條件對小膠質細胞炎癥模型評價的影響 用LPS處理未包被、Matrigel、PDL、I型膠原蛋白包被4種條件下的小膠質細胞，多因子檢測數據結果如Tab 4所示。Matrigel包被條件下加入LPS刺激，各炎癥因子表達量均無明顯上升，而未包被條件下，加入LPS刺激后，各炎癥因子濃度明顯升高，且均高于PDL和I型膠原蛋白包被條件。說明小膠質細胞在未包被條件下，對LPS的刺激更為敏感，與qPCR結果一致；PDL包被和I型膠原蛋白包被條件下，小膠質細胞對LPS的敏感性差異無顯著性，在Matrigel包被條件下，小膠質細胞對LPS基本不敏感。

Fig 7 Morphology of mixed glial cultured with different culture materials

A～B: Different materials cultured mixed glial without LPS treatment; C, D: Different materials culture mixed glial treated with 100 μg·L-1LPS for 48 h. A and C were cultured on uncoated material, B and D were cultured on Matrigel coated plate.

4 討論

混合膠質細胞在炎癥反應強度與廣度上均優(yōu)于提純后的小膠質細胞?；旌夏z質細胞中，小膠質細胞的比例通常不會超過5%。因此，盡管多因子檢測結果中，小膠質細胞的炎癥因子濃度更高，但考慮到細胞比例后，實際上混合膠質細胞中的小膠質細胞分泌炎癥因子的能力更強。例如，未包被條件下，經LPS(100 μg·L-1)處理后，105個混合膠質細胞中，含有5×103個小膠質細胞，IL-6的濃度為692.9±75.4 ng·L-1，而提純的小膠質細胞在同等細胞數量時僅能產生465.6±130.4 ng·L-1的IL-6。說明星形膠質細胞不僅可貢獻如IL-6等炎癥因子，還通過細胞間協同作用向小膠質細胞提供正反饋。

對多因子檢測實驗的數據進行深入分析，可發(fā)現以下幾個特點：① Ⅰ型膠原蛋白與PDL包被材料培養(yǎng)的膠質細胞，炎癥因子濃度與構成基本一致，僅在小膠質細胞培養(yǎng)體系中RANTES(CCL5) 的表達量相差10倍，其余因子濃度均在相同數量級。② 培養(yǎng)材料用Matrigel包被培養(yǎng)的細胞炎癥因子成分與比例較其它培養(yǎng)材料有較大不同，例如混合膠質細胞培養(yǎng)體系中，Matrigel包被條件下的KC(CXCL1)分泌量達到其他條件下的15～20倍，其他指標亦超過非Matrigel包被的數倍，但IL-12p40分泌量卻與其他環(huán)境接近。③ 將相同培養(yǎng)環(huán)境中小膠質細胞與混合膠質細胞的炎癥因子分泌情況進行比較。在有包被情況下，混合膠質細胞的KC與MCP1(CCL2)分泌量均明顯高于小膠質細胞，有的差異甚至達到多個數量級。這說明星形膠質細胞亦參與了這兩種趨化因子的分泌。在未包被條件下，小膠質細胞的炎癥因子分泌量則普遍較高。④ 混合膠質細胞在PDL包被條件下，LPS刺激導致IL-1α與IL-1β的mRNA轉錄量出現大幅提升，而其蛋白濃度提高卻不甚明顯。這提示了炎癥模型評價以蛋白濃度變化為準的重要性。

用Matrigel包被的培養(yǎng)材料培養(yǎng)混合膠質細胞，其表層可觀察到小膠質細胞密度明顯高于其他材料培養(yǎng)時的細胞密度，且細胞狀態(tài)更佳。而且，LPS刺激Matrigel包被條件下培養(yǎng)的混合膠質細胞，表面的小膠質細胞形態(tài)與其在小鼠體內的形態(tài)高度接近[16]，說明Matrigel包被培養(yǎng)的混合膠質細胞為小膠質細胞提供了接近體內的生長環(huán)境。相反，因為在Matrigel包被的培養(yǎng)材料中，小膠質細胞對LPS的敏感性顯著下降，因此，當研究者需要使用提純的小膠質細胞時，應避免使用Matrigel包被的培養(yǎng)材料。此時應用未包被的材料培養(yǎng)，雖會犧牲一部分貼壁能力較差的細胞，卻能保證細胞對LPS等刺激因子具有高度的敏感性。

此外，根據本研究中qPCR與流式細胞檢測數據，神經細胞在體外培養(yǎng)2 d后即凋亡消失[17]，相反，星形膠質細胞與小膠質細胞的比例逐漸增加。不同于傳統方法中混合培養(yǎng)21 d后再分離、收集細胞的策略。因此，在時間緊迫時，可提高起始動物只數，從而可將實驗周期縮短至7 d。

本研究通過將多種新材料和新技術應用于小鼠膠質細胞的分離培養(yǎng)，比較傳統培養(yǎng)方法和新材料新技術的區(qū)別。通過本研究，可以得出以下結論：① 對于建立神經膠質細胞炎癥模型，應使用混合膠質細胞；② 使用Matrigel替代傳統的PDL作為培養(yǎng)材料的首選包被液，以達到最大程度模擬體內環(huán)境、提高細胞活力的目的；③ 建立炎癥模型應以蛋白水平炎癥因子檢測為主要指標。

(致謝：本實驗在軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所特殊環(huán)境組學研究室進行，在此向所有幫助我的老師和同學表示由衷的感謝！)