李夢佳，徐 琦，程路峰

(新疆醫(yī)科大學(xué)1. 藥學(xué)院藥理學(xué)教研室、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

心肌纖維化是慢性心衰發(fā)展過程中的最重要的病理表現(xiàn)，但發(fā)病機(jī)制尚未完全揭示，主要認(rèn)為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)過度激活是導(dǎo)致心肌纖維化的因素?？剐募±w維化的一線藥物血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin coverting enzyme inhibitor，ACEI)或血管緊張素Ⅱ一型受體拮抗劑(angiotensinⅡ type1 receptor antagonist，AT1)長期應(yīng)用出現(xiàn)“醛固酮逃逸”現(xiàn)象[1]。醛固酮將會促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)等的表達(dá)，進(jìn)而刺激多種細(xì)胞向纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加基質(zhì)蛋白等的合成而促纖維化[2-3]。因此，闡明心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，及預(yù)防和治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

有報(bào)道稱[4]，多種免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T lymphocytes，Tregs)構(gòu)建了T細(xì)胞的抗炎體系。自然性Tregs來源于胸腺，誘導(dǎo)型則依賴局部炎癥環(huán)境產(chǎn)生。CD4+T淋巴細(xì)胞活化后，TGF-β的促進(jìn)下向Tregs細(xì)胞分化，且通過進(jìn)一步自分泌TGF-β等因子而被活化增殖(正反饋)。Tregs主要分泌TGF-β和IL-10，有報(bào)道[5]，靜脈回輸Tregs主要通過IL-10介導(dǎo)而逆轉(zhuǎn)心肌纖維化。但是，TGF-β又是重要的致纖維化因子，故Tregs細(xì)胞在心肌纖維化進(jìn)程中扮演怎樣的角色還需進(jìn)一步證實(shí)。

Kv1.3通道作為調(diào)控T淋巴細(xì)胞增殖的靶點(diǎn)意義重大，其通過維持細(xì)胞靜息膜電位，使T細(xì)胞處于能被活化的狀態(tài)[8]，T細(xì)胞活化后，促進(jìn)第二信使Ca2+內(nèi)流，增加細(xì)胞因子TGF-β的轉(zhuǎn)錄。通過阻斷Kv1.3通道能抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和體外增殖[6-7]。前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，Tregs可通過分泌較多的TGF-β，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)的增殖，而依普利酮?jiǎng)t可能通過阻斷Kv1.3通道，抑制Tregs細(xì)胞活化增殖，減少TGF-β的分泌，而未引起CFs的增殖。基于此，本研究通過沉默Kv1.3通道基因并轉(zhuǎn)染Tregs細(xì)胞，擬進(jìn)一步明確Kv1.3通道在Tregs細(xì)胞活化增殖致心肌纖維化的靶點(diǎn)地位，明確依普利酮是否通過直接阻斷Kv1.3通道功能，抑制Tregs細(xì)胞活化增殖而抑制纖維化進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號: SYXK(新)2016-0003。

1.2 藥物與試劑Biotin小鼠抗兔CD4(BD554836)、PE小鼠抗大鼠CD25(BD554866)，購自美國BD公司；Multisort microbeads Kit、Anti-PE Microbeads，購自德國Miltenyi Biotic公司；依普利酮、大鼠淋巴分離液(LTS 1083)、胎牛血清，購自Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，購自HyClone公司；SYBRTMSelect Master Mix,購自Life Technologies；抗大鼠CD3單抗、抗大鼠CD28單抗，購自Thermofisher eBioscience公司；重組大鼠IL-2、TGF-β1，購自Peprotech公司；IL-10、TGF-β試劑盒，購自武漢華美生物技術(shù)有限公司；靶向抑制Kv1.3的慢病毒載體及陰性對照病毒載體，由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建及包裝。

1.3 儀器Midi型磁力架分選器、25LS型分選柱(德國Miltenyi)；KDC 40低速離心機(jī)(中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；HF 240二氧化碳培養(yǎng)箱(Heal Force)；CT15RE型低溫離心機(jī)(日本Hitachi)；Port-a-path?工作站、負(fù)壓控制器、NPC?-1芯片(德國Nanion，Part-a-Patch?NPC?-1)；EPC-10放大器(德國HEKA)。

1.4 方法

1.4.1大鼠Tregs細(xì)胞的分選及活化 摘取正常大鼠脾臟，通過加入大鼠淋巴分離液，密度梯度離心得到單個(gè)核細(xì)胞；免疫磁珠雙陽性分選兩步法獲得Tregs細(xì)胞(純度≥95%)。將分離好的Tregs細(xì)胞接種于前1 d由CD3抗體包被過夜，并于次日吸出CD3抗體，用等體積的PBS體積洗板1次，含CD28抗體(2 mg·L-1)的24孔板中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度下，用含IL-2(10 g·L-1)、TGF-β1(5 μg·L-1)、雙抗100 kU·L-1及RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL培養(yǎng)活化該細(xì)胞，細(xì)胞在刺激24 h后體積略微增大，進(jìn)入活化狀態(tài)，刺激48 h可進(jìn)行病毒感染。

1.4.2RNAi-Kv1.3通道基因轉(zhuǎn)染大鼠Tregs細(xì)胞 收集活化的Tregs細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基饑餓Tregs細(xì)胞12 h,以備轉(zhuǎn)染。按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的濃度接種于24孔板中，按MOI=100，將LV-KCNA3(64803-1)、LV-KCNA3(64804-1)、LV-KCNA3(64805-1)3個(gè)不同的干擾靶點(diǎn)及陰性對照病毒CON077(No target Kv1.3)(Tab 1)，分別加入活化的Tregs細(xì)胞，同時(shí)加入感染增強(qiáng)液聚凝胺至終濃度6 μg ·L-1,最終感染體積為500 μL，十字交叉法晃動24孔板以保證鋪板均勻；于1 000 r·min-1離心感染60 min。離心結(jié)束后，將平板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,于次日加入500 μL含IL-2 (10 μg·L-1)、TGF-β1(5 μg·L-1)、雙抗100 kU·L-1及RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光。

Tab 1 Targeted interference sequences

1.4.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測Kv1.3通道基因的表達(dá) 將LV-KCNA3(64803-1)、LV-KCNA3(64804-1)、LV-KCNA3(64805-1)三個(gè)不同的干擾靶點(diǎn)及陰性對照病毒CON077(No target Kv1.3)，感染Tregs細(xì)胞成功后，TRIzol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,于冰上將2.0 μL cDNA加入擴(kuò)增體系(SYBR 5 μL、Prim 0.7 μL、H2O 1.6 μL)，共10 μL。反應(yīng)條件為：61 ℃、5 min，42 ℃、1 h，70 ℃、5 min，4 ℃循環(huán)。PCR反應(yīng)以GAPDH作為內(nèi)參照(管家基因)，每個(gè)樣本均以GAPDH的表達(dá)來標(biāo)準(zhǔn)化，所有孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以相對定量2-△△CT表示目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)，△△CT=實(shí)驗(yàn)組(目的基因的拷貝數(shù)-管家基因的拷貝數(shù))/對照組(目的基因的拷貝數(shù)-管家基因的拷貝數(shù))。同時(shí)比較干擾載體組及陰性對照病毒組基因的表達(dá)量，計(jì)算干擾效果。引物序列見Tab 2。

Tab 2 Primer sequences

1.4.4全細(xì)胞膜片鉗檢測正常組Tregs、RNAi-Kv1.3 Tregs細(xì)胞電流變化 使用EPC10放大器，負(fù)壓控制器通過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器與計(jì)算機(jī)連接，刺激信號及電流、電壓輸人信號的采集均由軟件控制。NPC?-1芯片內(nèi)層注入5 μL電極內(nèi)液，NPC?-1芯片電極入水阻抗為8～12 MΩ。膜電位鉗制在-80 mV，Tregs細(xì)胞Kv1.3鉀通道予以-80～+40 mV斜率刺激，刺激時(shí)長為500 ms。記錄得到Kv1.3鉀通道的電流-電壓(I-V)曲線。

1.4.5細(xì)胞因子水平檢測 將細(xì)胞分為Tregs組、Tregs+EPL組、RNAi-Tregs組、RNAi-Tregs+EPL組，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，外液通過1 300 r·min-1離心10 min,收集上清液，分裝置于200 μL EP管(避免反復(fù)凍融)；內(nèi)液細(xì)胞分泌因子通過PBS清洗，放在-20 ℃冰箱10 min，37 ℃水浴鍋中5 min，如此反復(fù)凍融3～5次，離心收集上清液。按照試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞內(nèi)外液分泌的IL-10、TGF-β水平。

2 結(jié)果

2.1 Treg細(xì)胞的分選免疫磁珠分選的Tregs細(xì)胞經(jīng)過CD3/CD28刺激活化，細(xì)胞體積變大，邊緣透亮(Fig 1)。

Fig 1 Tregs and CFs cell separation

A: Immunomagnetic beads separation Tregs cell (×200); B: Stimulate the activation of Tregs by CD3/CD28 (×100); C: Stimulate the activation of Tregs by CD3/CD28 (×200); D: Lentivirus infects Tregs cell(×200).

2.2 RNAi-Kv1.3轉(zhuǎn)染大鼠Tregs細(xì)胞Tregs細(xì)胞在MOI=100、感染增強(qiáng)液聚凝胺6 μg L-1、離心轉(zhuǎn)染條件下，進(jìn)行GFP慢病毒轉(zhuǎn)染后，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到GFP綠色熒光蛋白(Fig 2)。

Fig 2 Tregs cells infected by lentivirus

2.3 RNAi Kv1.3轉(zhuǎn)染Treg細(xì)胞對Kv1.3通道m(xù)RNA表達(dá)的影響LV-Kcna3 64803-1(Kv1.3-64803)、LV-Kcna3 64804-1(Kv1.3-64804)、LV-Kcna3 64805-1(Kv1.3-64805)三個(gè)不同的干擾靶點(diǎn)及陰性對照病毒CON077(No target Kv1.3)感染Tregs細(xì)胞成功后，Kv1.3-64803轉(zhuǎn)染Tregs細(xì)胞Kv1.3 mRNA表達(dá)較其他各組表達(dá)明顯較低(P<0.01)，其中干擾靶點(diǎn)Kv1.3-64803對Tregs細(xì)胞mRNA抑制率最大為78%(Fig 3)。

Fig 3 Relative expression and inhibition rate of Kv1.3 channel mRNA in each

A:Control;B:NO-target kv1.3;C:KV1.3-64803;D:KV1.3-64804;E:KV1.3-64805.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsKv1.3-64804orKv1.3-64805

2.4 RNAi-Kv1.3轉(zhuǎn)染Treg細(xì)胞對Kv1.3通道電流密度的影響全細(xì)胞膜片鉗模式測定正常Tregs細(xì)胞與沉默組Tregs細(xì)胞在+40 mV Kv1.3鉀通道電流變化，與正常組Tregs細(xì)胞Kv1.3鉀通道+40 mV的電流峰值密度[(601.7±11.76) pA/pF，n=10]相比，沉默組峰值電流密度[(172.5± 16.94) pA/pF，n=12]，抑制率為71.3%(Fig 4)。

Fig 4 Kv1.3 channel current changes between normal group and silent group

A: The original graph of the current density with the slope stimulation,the dotted line is the standard error; B: The Kv1.3 current density bar chart under +40 mv.**P<0.01vscontrol.

Tab 3 IL-10,TGF-β levels secreted by Tregs(ng·L-1,n=8)

GroupIL-10IntracellularExtracellularTGF-βIntracellularExtracellularTregs28.48±2.7938.37±4.88174.18±4.15154.96±1.29Tregs+EPL26.53±4.6027.01±3.90?139.54±3.90??124.05±0.56?RNAi-Tregs26.58±1.8633.96±2.88123.49±1.91??111.59±4.27??RNAi-Tregs+EPL21.47±1.5132.79±1.92120.56±2.47110.66±0.91

*P<0.05,**P<0.01vsTregs

2.5 Tregs細(xì)胞分泌IL-10、TGF-βELSIA法檢測細(xì)胞Tregs組、Tregs+EPL組、RNAi-Tregs組、RNAi-Tregs+EPL組IL-10、TGF-β分泌水平，EPL濃度為30 μmol·L-1。與Tregs組相比，RNAi-Tregs組內(nèi)外液TGF-β水平明顯降低(P<0.01)，Tregs+EPL組內(nèi)外液TGF-β水平亦降低(P<0.05)；與RNAi-Tregs組相比，RNAi-Tregs+EPL組內(nèi)外液TGF-β水平無明顯變化；而Tregs組、Tregs+EPL組、RNAi-Tregs組和RNAi-Tregs+EPL組內(nèi)外液IL-10水平無明顯變化(Tab 3)。

3 討論

Tregs在機(jī)體免疫與平衡中占據(jù)著重要地位。但是，Tregs在炎癥情況下對器官纖維化的作用并未引起足夠重視，而且有爭議：一種假設(shè)認(rèn)為免疫抑制Tregs能引起器官纖維化；另一種觀點(diǎn)卻認(rèn)為，Tregs主要分泌TGF-β而導(dǎo)致了纖維化。因此，減少不必要的T淋巴細(xì)胞活化或增強(qiáng)Tregs細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，有可能作為治療心力衰竭的新靶標(biāo)[9-10]。

越來越多的間接和直接證據(jù)提示，Kv1.3通道與Tregs細(xì)胞的關(guān)系密切。Varga等[11]在多發(fā)性硬化患者的Tregs中發(fā)現(xiàn)Kv1.3通道含量較少。Estes等[12]利用高通量定量方法，分析了人初始淋巴細(xì)胞的K+通道功能性活動，結(jié)果提示Kv1.3通道的活性可作為T細(xì)胞的功能活性標(biāo)志物。而既往的研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，可以通過沉默記憶T細(xì)胞上的Kv1.3通道，作為治療自身性免疫性疾病的一種手段。因此，RNAi技術(shù)在細(xì)胞與分子水平上很大程度上都得到了廣泛應(yīng)用。本研究通過采用RNAi技術(shù)，將RNAi-Kv1.3慢病毒載體轉(zhuǎn)染至大鼠Tregs細(xì)胞。Tregs細(xì)胞主要為懸浮細(xì)胞，非貼壁生長，難轉(zhuǎn)染。經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，沉默組Kv1.3通道基因水平抑制率達(dá)到78.0%，電流降低71.3%。ELSIA法檢測Tregs細(xì)胞分泌因子水平，Tregs+EPL組內(nèi)外液TGF-β水平降低，RNAi-Tregs組內(nèi)外液TGF-β水平也明顯降低，但是RNAi-Tregs+EPL組內(nèi)外液TGF-β水平相比RNAi-Tregs組卻無明顯變化。而體外不給予EPL或給予EPL情況下，RNAi-Kv1.3 Tregs組并沒有任何變化，這表明沉默Kv1.3通道后，EPL不再發(fā)揮抑制Tregs細(xì)胞分泌TGF-β水平；且沉默Kv1.3通道后，可抑制Tregs細(xì)胞內(nèi)外液分泌的TGF-β水平，與EPL可通過下調(diào)Tregs細(xì)胞Kv1.3通道表達(dá)，進(jìn)而抑制Tregs細(xì)胞內(nèi)外液分泌的TGF-β水平結(jié)果相一致。這表明Kv1.3通道在Tregs細(xì)胞調(diào)控纖維化的作用中扮演著重要角色。

以上研究結(jié)果闡明了Kv1.3通道介導(dǎo)著Tregs細(xì)胞的活化增殖，而EPL可通過直接抑制Kv1.3通道，進(jìn)而減少TGF-β的分泌，從而抑制心肌纖維化，這與我們前期分子對接顯示結(jié)果相一致[16]。提示Kv1.3通道可作為心衰診治的潛在免疫學(xué)靶點(diǎn)。