宋小青，王革玲

(湖北江漢油田總醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北潛江 433124)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，多發(fā)于30～50歲女性，近年來有年輕化趨勢[1]。早期宮頸癌患者常無明顯癥狀和體征，宮頸可光滑或難與宮頸柱狀上皮異位區(qū)別，此類患者多因?qū)m頸外觀正常易漏診或誤診。隨著病變發(fā)展，可出現(xiàn)陰道流血、陰道排液，甚至出現(xiàn)尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等晚期臨床癥狀，此時患者多已處于中晚期，預(yù)后往往較差。目前宮頸癌的診斷主要依賴宮頸刮片細胞學(xué)檢查、宮頸和宮頸管活組織檢查等病理學(xué)檢查，但上述操作均為有創(chuàng)性檢查，給患者造成了一定的痛苦，這也會導(dǎo)致人們不愿意定期進行篩查[2]。故而，尋找有效、穩(wěn)定的生物學(xué)標(biāo)志物無疑可為宮頸癌的治療贏得時間，對提高患者生存率，改善其生存質(zhì)量具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。LncRNA是一類長約200 nt的非編碼RNA，通過表觀遺傳調(diào)控參與各種生理病理過程，已被證實在前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌等泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中具有較大診斷價值[4-7]。本研究收集了130例經(jīng)病理確診的宮頸癌患者，同期收取130例宮頸炎患者和130例體檢健康女性，檢測并比較3組研究對象血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平，分析三者與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系及對宮頸癌鑒別診斷的價值，旨在為宮頸癌的早期篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年8月至2018年4月在本院經(jīng)病理學(xué)/細胞學(xué)確診的宮頸癌患者130例。年齡25～54歲，平均(38.0±4.6)歲。其中鱗癌89例，腺癌25例，腺鱗癌16例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期87例，Ⅲ～Ⅳ期43例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移90例。宮頸癌的診斷、病理分型及分期依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實踐指南2015年第2版[8]。同期收取130例宮頸炎患者，年齡23～46歲，平均(35.9±4.1)歲。宮頸炎的診斷依據(jù)2015年美國疾病預(yù)防與控制中心(CDC)指南[9]。此外，收取130例本院體檢健康女性，年齡24～48歲，平均(36.9±4.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)宮頸癌患者未接受放化療治療；(2)意識清楚，語言表達能力正常，能與調(diào)查人員進行正常的溝通；(3)與研究者進行研究目的溝通后，研究對象自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他腫瘤疾病史者；(2)排除腦卒中、老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的無法采集相關(guān)信息和精神分裂癥的患者；(3)患者或患者家屬不愿意參與研究者。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2臨床資料與樣本的采集 由研究人員記錄患者的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史等基本信息，BMI計算方法為體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。使用促凝采血管收集經(jīng)禁食10 h以上宮頸癌及宮頸炎患者接受治療前和健康對照者入院體檢時的靜脈血5 mL。收集的標(biāo)本在1 h內(nèi)于4 ℃離心機(中國湘儀集團H-1850R型)以3 500 r/min離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測。

1.3血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1相對表達量檢測 血清總RNA的提取按照血液RNA提取試劑盒(中國Bioteke公司)說明書步驟進行。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)(美國Bio-Rad公司C1000型)。RT-PCR按照SYBR GREEN(中國康為世紀(jì)公司)說明書進行，反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。內(nèi)參基因采用GAPDH。應(yīng)用PrimerPremier5.0進行PCR引物設(shè)計，引物序列為：LncRNA-H19上游：5′-AAT CCT TTA TGT GAC CAG AA-3′，下游：5′-CTC CTT TGT TGA ATC CAT-3′；LncRNA-ATB上游引物：5′-AGT GTG TCC TGT TCT CCC AGT-3′下游引物：5′-TGG GGG AAT CTT TCG CAT T-3′； LncRNA-UCA1上游引物：5′-AGT GTG TCC TGT TCT CCC AGT-3′下游引物：5′-TGG GGG AAT CTT TCG CAT T-3′；GAPDH上游：5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′， 下游：5′-GCA GGA GGC ATT GCT GAT GAT-3′。引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供。采用2-ΔΔCt法計算LncRNA的相對表達量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。RT-PCR結(jié)果顯示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1和GAPDH基因熔解曲線峰型單一，說明引物沒有形成引物二聚體，也沒有非特異性擴增，如圖1。同時計算血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1檢測的批內(nèi)、批間變異系數(shù)，以評估實驗的重復(fù)性和精確度。

注：圖A示LncRNA-H19；圖B示LncRNA-ATB；圖C示LncRNA-UCA1；圖D示GAPDH

圖1LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1和GAPDH基因熔解曲線峰型

2 結(jié) 果

2.1基本資料及血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平比較 宮頸癌患者、宮頸炎患者和體檢健康者之間在年齡、BMI、吸煙、飲酒差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與宮頸炎患者和體檢健康者相比，宮頸癌患者血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而宮頸炎患者和體檢健康者間血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1與宮頸癌臨床特征的關(guān)系 如表2所示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1表達水平與宮頸癌患者的年齡、BMI、吸煙、飲酒和組織學(xué)類型等因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與宮頸癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LncRNA-H19：r=0.521，P=0.006；LncRNA-ATB：r=0.505，P=0.011；LncRNA-UCA1：r=0.486，P=0.023)及患者TNM分級(LncRNA-H19：r=0.513，P=0.016；LncRNA-ATB：r=0.591，P=0.003；LncRNA-UCA1：r=0.509，P=0.007)呈線性關(guān)聯(lián)。

表1 基本資料及血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平比較

注：與宮頸癌患者比較，aP<0.05

表2 血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1與宮頸癌臨床特征的關(guān)系

表3 血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1對宮頸癌的風(fēng)險評估

注：a表示校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素

2.3血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1對宮頸癌的鑒別價值 ROC曲線分析顯示，血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對照者的AUC分別為0.815(95%CI：0.672～0.908，P<0.001)、0.841(95%CI：0.754～0.927，P<0.001)和0.612(95%CI：0.558～0.706，P=0.002)；在各指標(biāo)約登指數(shù)為最大值時對應(yīng)的靈敏度/特異度分別為：78.5%/86.9%、78.7%/90.7%和70.2%/59.3%；診斷界值分別為8.6(-log)、28.8(-log)和9.5(-log)，見圖2A。聯(lián)合血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對照者的AUC為0.923(95%CI：0.893～0.974，P<0.001)，靈敏度92.3%，特異度83.4%，見圖2B。

2.4血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1對宮頸癌的風(fēng)險評估 單因素分析顯示，血清高LncRNA-H19、高LncRNA-ATB和高LncRNA-UCA1水平是宮頸癌發(fā)病的危險因素(P<0.05)；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素后，血清高LncRNA-H19、高LncRNA-ATB和高LncRNA-UCA1水平仍是宮頸癌發(fā)病的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

注：A圖示血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對照；B圖示聯(lián)合血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-UCA1在區(qū)分宮頸癌與宮頸炎和健康對照

圖2血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB、LncRNA-

UCA1對宮頸癌鑒別價值

3 討 論

宮頸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、侵襲性強以及預(yù)后差等特點，是威脅人群健康的主要疾病之一[10]。生物標(biāo)志物是血液、尿液或者組織中能檢測疾病狀態(tài)的分子指標(biāo)，可用于疾病的檢測與評估[11-12]。它們在體液中的水平變化可以提供疾病進展情況的相關(guān)信息，理想情況下，生物標(biāo)志物應(yīng)具有檢測早期小塊腫瘤的高靈敏度、高特異度，并且在非腫瘤中不會增加。目前，對于宮頸癌的診斷仍然缺乏有效指標(biāo)，導(dǎo)致這類患者預(yù)后較差，而生物標(biāo)志物的早期檢測可顯著提高宮頸癌患者的生存率。

近年來，關(guān)于LncRNAs在宮頸癌領(lǐng)域的相關(guān)功能學(xué)研究逐漸成為新的熱點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近10種LncRNAs與宮頸癌細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程有關(guān)。例如，PENG等[13]對419例宮頸癌患者的一項薈萃分析結(jié)果表明，LncRNA-H19表達水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期等密切相關(guān)，且高水平的LncRNA-H19提示更差的臨床預(yù)后。隨后研究發(fā)現(xiàn)其可能的機制是LncRNA-H19可誘導(dǎo)腫瘤組織高表達癌基因HOXA11，從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。LncRNA-ATB也被證實參與宮頸癌的發(fā)病過程。CAO等[15]對50對宮頸癌及癌旁組織中LncRNA-ATB的表達進行比較分析發(fā)現(xiàn)，癌組織中LncRNA-ATB表達水平顯著高于癌旁組織，提示LncRNA-ATB對鑒別診斷宮頸癌具有潛在價值，進一步利用永生化宮頸癌Hela細胞系進行體外實驗的結(jié)果表明，LncRNA-ATB可通過TGF-β途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進一步促進宮頸癌細胞的耐藥，并增強其侵襲能力。除LncRNA-H19與LncRNA-ATB外，近年來關(guān)于LncRNA-UCA1與宮頸癌的研究也有一定進展。例如，F(xiàn)ANG等[16]的體外實驗證實，LncRNA-UCA1可作為內(nèi)源競爭RNA取代miR-184并上調(diào)DUSP7表達，進而促進宮頸癌的發(fā)病。FAN等[17]發(fā)現(xiàn)，LncRNA-UCA1在宮頸癌等多種腫瘤組織中均呈高表達狀態(tài)，而靶向抑制LncRNA-UCA1則可促進宮頸癌細胞凋亡，并降低其遷移能力。上述研究結(jié)果提示，LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1可通過多種途徑參與宮頸癌的發(fā)病過程，而三者的異常表達可能為宮頸癌的早期診斷提供線索，但目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于聯(lián)合上述3種LncRNA與宮頸癌診斷的相關(guān)報道。

在本次研究中，筆者探究了血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1對宮頸癌的診斷價值，并分析了三者與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，宮頸癌患者血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平較宮頸炎及健康對照者顯著增高，該研究結(jié)果與前期多個研究結(jié)果相符[13-17]。聯(lián)合3項指標(biāo)診斷宮頸癌的靈敏度高達92.3%，顯著高于單項指標(biāo)靈敏度，表明聯(lián)合檢測血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1診斷宮頸癌具有一定價值，可考慮在臨床推廣使用。此外，本研究再次證實，LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1表達水平與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，Logistic回歸多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素影響后，血清高LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1水平仍是宮頸癌發(fā)病的獨立危險因素，上述這些結(jié)論與前期國外研究結(jié)果相一致[14-15,17]，表明LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1表達水平對宮頸癌患者腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定預(yù)測作用。然而，本次研究仍有以下不足：(1)本次研究納入的患者均來自于本院，這可能會對研究結(jié)果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊列研究來進一步驗證研究結(jié)果；(2)本研究納入130例宮頸癌患者，患者的例數(shù)仍然有限，后期需要更大樣本量的研究來證實血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1在我國宮頸癌患者中的臨床價值。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)血清LncRNA-H19、LncRNA-ATB和LncRNA-UCA1對宮頸癌的診斷及發(fā)病風(fēng)險評估中具有潛在價值，有望為宮頸癌的臨床診療提供新思路。