王 波，楊婷婷，李 志

(大連市中心醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116033)

肝纖維化是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生按嚴重程度，分為早期階段(肝纖維化期階段)和晚期階段(肝硬化期)，肝硬化是由各種因素導致慢性肝損害的一類晚期肝纖維化疾病[1]。肝纖維化期是可逆階段，如果能早期診斷并給予抗纖維化治療，肝臟功能可能恢復到正?；蚪咏顟B(tài)，可預防肝硬化的發(fā)生[2]。α-烯醇化酶是一種可以在肝纖維化患者體內(nèi)誘發(fā)自身免疫應答的自身抗原，通過原癌基因c-myc的抑制作用來調(diào)整細胞生長和分化[3]。國外有研究證實抗α-烯醇化酶的自身抗體在肝纖維化期階段患者的血清中出現(xiàn)頻率相當高，可以作為一種潛在的預測因子[4]。本研究通過原核表達技術(shù)獲取人α-烯醇化酶，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)反應模式檢測肝纖維化期和肝硬化患者及健康者血清中抗α-烯醇化酶的自身抗體，評價α-烯醇化酶對肝纖維化的早期診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集處于肝纖維化期階段(0～3期)的患者35例，肝硬化患者48例，肝纖維化的組織病理學分期采用METAVIR評分系統(tǒng)；另選取本院體檢健康者60例作為健康對照組，無免疫性及明顯的肝炎疾病證據(jù)。對照組與患者組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2菌株與試劑 克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector、表達感受態(tài)菌BL21(DE3) 等購于北京全式金生物公司；ENO1 cDNA，ENO1抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Mastermix購于北京天根生化科技有限公司；凝膠成像儀為UVPINC公司產(chǎn)品；包被液、酶標抗人Ig-G為惠民生物技術(shù)公司產(chǎn)品；酶標儀為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3實驗方法

1.3.1ENO1基因的克隆及表達 根據(jù)GenBank中ENO1的cDNA基因序列，設(shè)計其中的ENO1基因特異性引物，上、下游引物分別為P1：5′-CGG ATC CAT GTC TAT TCT CAA GAT CCA TGC C-3′，P2：5′-CAA GCT TTT ACT TGG CCA AGG GG-3′；PCR擴增目的基因ENO1；目的片段回收后與克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細胞后，涂布于Amp/LB平板上，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒。將測序正確的克隆質(zhì)粒和pET32a(+)表達質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI/HindⅢ雙酶切，切膠回收目的片段，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細胞，于Amp/LB平板上挑取單個克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定；將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)菌株BL21(DE3)中，經(jīng)篩選和增菌后用微生物總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，SDS-PAGE電泳分析表達產(chǎn)物，回收純化重組蛋白并定量分析，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2ELISA方法的建立 利用方陣滴定法確定抗原包被濃度、血清稀釋度和作用時間等反應參數(shù)，陽性反應的cut-off值是健康混合血清加3個標準差的平均光密度值，最終確定包被抗原濃度為5 μg/mL，血清稀釋度為1∶50時，P/N相差較大為最佳稀釋濃度。

1.3.3用所建立的ELISA 方法進行標本的檢測 (1)包被抗原：用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋ENO1抗原(原濃度為230 μg/mL)濃度至5 μg/mL，100微升/孔，4 ℃過夜，洗液(PBS+0.05%吐溫20)沖洗3次；(2)封閉：封閉液(PBS+1%BSA+0.1%吐溫20)室溫封閉2 h，洗板3次；(3)加待測抗體：將肝纖維化早期患者、肝硬化期患者及健康對照組血清分別稀釋后加入封閉后的酶標板100微升/孔，每孔設(shè)置平行對照；(4)加二抗：每孔加辣根過氧化物酶標記抗人Ig-G 100 μL,水浴40 min；(5)每孔加終止液TMB 100 μL終止反應，水浴顯色15 min后測定OD值。

1.4應用免疫印跡法分析驗證ELISA 對肝纖維化期血清標本的抗α-烯醇化酶的自身抗體進行免疫印跡分析，對免疫印跡結(jié)果和ELISA結(jié)果進行分析，驗證2種方法陽性檢出率是否相等。

1.5統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析應用SPSS19.0系統(tǒng)，陽性率比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1ENO1基因的克隆及表達 通過PCR擴增目的基因ENO1，擴增產(chǎn)物大小約為 1 300 bp，與預期結(jié)果相符(見圖1)。重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)/ENO1經(jīng)IPTG誘導后，蛋白主要以可溶性上清形式存在，純化后電泳顯示為單一蛋白條帶：蛋白ENO1理論值47×103(連接pET-32a載體包含硫氧還蛋白Trx和HIS-tag標簽約20×103，故重組蛋白67×103左右)，見圖2。

注：M為DNA marker，1為ENO1基因擴增片段

圖1ENO1基因PCR產(chǎn)物電泳圖

注：M為蛋白質(zhì)標準，1為純化后ENO1

圖2純化蛋白SDS電泳圖

2.2臨床標本的檢測 用所建立的ELISA方法檢測肝纖維化期患者、肝硬化期患者及健康對照組血清中抗α-烯醇化酶自身抗體，結(jié)果顯示在肝纖維化期和肝硬化期患者中，抗α-烯醇化酶自身抗體的陽性率高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.74,P<0.05)，且在肝纖維化期患者中也顯著高于肝硬化期患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.27,P<0.05)，見表1。

表1 各組外周血中抗α-烯醇化酶自身抗體結(jié)果

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與肝硬化組比較，▲P<0.05

2.3免疫印跡法分析驗證ELISA結(jié)果 對35例肝纖維化期患者血清α-烯醇化酶進行免疫印跡分析，證實了酶聯(lián)免疫法和免疫印跡法2種檢測方法檢出率的一致性(χ2=0.33,P>0.05)，在酶聯(lián)免疫方法中抗α-烯醇化酶陽性的血清在免疫印跡法中也可得到證實，見表2。

表2 ELISA和免疫印跡法陽性率驗證結(jié)果(n)

3 討 論

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理學過程，普遍認為肝纖維化的過程是可逆的，適當有效的治療不僅可減緩其向肝硬化的發(fā)展，甚至可減輕已有的肝纖維化程度[5]。因此阻止病情進展到肝硬化期，這有賴于對肝纖維化期階段的預測和診斷[6-7]。

α-烯醇化酶是一種可以在肝纖維化患者體內(nèi)誘發(fā)自身免疫應答的自身抗原，也是肝纖維化診斷的一種潛在的預測因素[4]。本研究表明可以通過原核表達技術(shù)獲取人源化的α-烯醇化酶，該蛋白是一種穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，以此作為抗原，建立血清學診斷模式，用所建立的ELISA方法檢測肝纖維化期患者、肝硬化期患者及健康對照組血清中抗α-烯醇化酶自身抗體，結(jié)果顯示在肝纖維化期和肝硬化期患者血清中，抗α-烯醇化酶自身抗體的陽性率高于健康對照組(P<0.05)，且在纖維化期患者中也顯著高于肝硬化期患者(P<0.05)。有研究表明，在自身免疫性肝炎的患者血清中抗α-烯醇化酶抗體的陽性率(50%～60%)，高于原發(fā)性膽汁性肝硬化(30%)和肝癌(14.3%)[4,8]?？梢钥闯觯S著肝臟疾病的進展，抗α-烯醇化酶抗體水平呈降低的趨勢，盡管現(xiàn)在缺少這種抗α-烯醇化酶抗體從良性肝臟疾病到末期疾病過程中水平變化的全面研究，但是檢測抗α-烯醇化酶抗體水平從肝纖維前期到肝硬化再到肝癌的變化表明抗α-烯醇化酶抗體的出現(xiàn)或許是肝臟疾病診斷的預示性標志物，也可以作為肝纖維化期的生物標志物。

盡管抗α-烯醇化酶抗體在肝纖維化形成過程中的發(fā)揮機制還不清楚，但有研究報道這種酶可以使纖維蛋白溶酶原結(jié)合在細胞表面，也可促使單核細胞在急性肺損傷時移向炎癥區(qū)域[9]。此外，據(jù)報道α-烯醇化酶可以被JNK信號(在纖維化中起積極作用)途徑調(diào)控[7]。因此α-烯醇化酶在促進免疫細胞趨向炎性反應區(qū)域的作用證明α-烯醇化酶也可能參與肝纖維化早期的炎性反應。然而隨著疾病進展到不可逆的纖維化晚期，很多因素參與到發(fā)病機制里，肝硬化期細胞外基質(zhì)比正常肝臟高6倍，因此推測α-烯醇化酶在肝纖維化早期作為一種促炎因子可起到重要作用，隨著疾病發(fā)展，細胞外基質(zhì)發(fā)揮主要作用，α-烯醇化酶的作用會逐漸減退，同時導致宿主對α-烯醇化酶的免疫應答減少。

肝纖維化的早發(fā)現(xiàn)、早治療可在一定程度上阻止疾病的發(fā)展，因此診斷早期纖維化的血清標志物非常重要，本研究證實了α-烯醇化酶作為一種潛在的預測因子對肝纖維化的早期診斷價值，其對早期干預治療、防止進展到肝硬化期、提高患者的生存率具有一定的應用價值。