安覃景，李思思，韓崇旭,3△

(1.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧大連 116044；2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院/揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，江蘇揚(yáng)州 225001；3.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇揚(yáng)州 225001)

胃癌是我國(guó)常見的腫瘤之一[1]，由于其早期臨床癥狀不明顯，潛伏期較長(zhǎng)，故大部分患者確診時(shí)已處于晚期階段。因此，胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療在提高患者生存率方面顯得尤為重要。近年來，生物信息學(xué)方法已成為篩選易感基因的常用分析工具。本研究通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)對(duì)中東亞人群的胃癌易感基因進(jìn)行挖掘，旨在從基因角度探索其發(fā)病機(jī)制，從而對(duì)胃癌的診斷和治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究資料均來自于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中東亞人群胃癌數(shù)據(jù)集GSE56807和GSE63089。

1.2研究方法 在GEO數(shù)據(jù)庫中利用GEO2R平臺(tái)的limma包分別對(duì)2個(gè)數(shù)據(jù)集的癌癥組織和正常胃組織進(jìn)行分析，取其交叉的差異表達(dá)基因提取相應(yīng)數(shù)據(jù)文件，進(jìn)而采用DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)在線對(duì)已獲取的差異表達(dá)基因分別從生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)3個(gè)方面進(jìn)行基因本體(GO)富集分析，并利用KOBA3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)其進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析。最終，利用STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫分析已獲取差異表達(dá)基因的相互作用，并去除孤立基因。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用GEO2R平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)及Bayes檢驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選，條件如下：(1)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義；(2)基因的表達(dá)量差異在4.00倍以上或0.25倍以下。GO富集分析采用Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析采用Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1芯片數(shù)據(jù)資料 本研究中共納入2個(gè)數(shù)據(jù)集，其包含胃癌組織及正常胃部組織，且數(shù)據(jù)集人群為中東亞人群，并未涉及胃癌分期和分級(jí)，見表1。

表1 數(shù)據(jù)集基本信息

2.2差異基因選取 在2個(gè)數(shù)據(jù)集間選擇交叉的40個(gè)基因，其在2個(gè)數(shù)據(jù)集中的方向一致。包括上調(diào)基因34個(gè)，下調(diào)基因6個(gè)。

注：雙Y軸圖中的Y軸分別為-log10P值和在某種生物學(xué)過程中差異基因的富集個(gè)數(shù)

圖1差異基因生物學(xué)過程分析的GO富集分析

2.3GO富集分析 GO富集分析的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)過程主要為12項(xiàng)，包括細(xì)胞黏附、獨(dú)立鈣的細(xì)胞黏附、細(xì)胞分裂、膠原蛋白分解代謝、細(xì)胞外基質(zhì)分解、有絲分裂核分裂、蛋白水解、細(xì)胞蛋白代謝、白細(xì)胞游走、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)控、有絲分裂細(xì)胞周期G2/M的轉(zhuǎn)變以及皮膚屏障的建立(P<0.05)，見圖1。筆者還發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因涉及的細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞外空間、紡錘體極、雙細(xì)胞緊密連接以及頂端漿膜等4項(xiàng)(P<0.05)，見圖2。涉及的相關(guān)分子功能為6項(xiàng)，包括氫-鉀交換ATP酶活性、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、蛋白酶結(jié)合、整合素結(jié)合、金屬異位酶活性及蛋白質(zhì)激酶結(jié)合(P<0.05)，見圖3。

注：雙Y軸圖中的Y軸分別為-log10P值和在某種細(xì)胞組分中差異基因的富集個(gè)數(shù)

圖2差異基因細(xì)胞組分的GO富集分析

注：雙Y軸圖中的Y軸分別為-log10P值和在某種分子功能中差異基因的富集個(gè)數(shù)

圖3差異基因分子功能的GO富集分析

2.4差異基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析 KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因涉及的通路大約有7個(gè)(P<0.01)，主要包括白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白遷移、p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期、丙型肝炎、胃酸分泌物收集、緊密連接及細(xì)胞黏附分子，見表2。

2.5差異基因的蛋白相互作用分析 STRING分析結(jié)果表明，發(fā)生相互作用的差異表達(dá)基因共計(jì)12個(gè)，分別為CKS2、ECT2、TPX2、DLGAP5、CCNB1、TOP2A、PBK、CCNB2、RRM2、CDC6、ARHGAP11A和CKAP2，上述差異表達(dá)基因可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起促進(jìn)或抑制作用，其中首次發(fā)現(xiàn)ARHGAP11A基因與胃癌相關(guān)。見圖4。

表2 差異基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析

圖4 差異基因的蛋白相互作用

3 討 論

目前，中國(guó)、日本和韓國(guó)等中東亞地區(qū)是胃癌好發(fā)地帶，新診斷胃癌人數(shù)占世界范圍的60%[2]。中東亞地區(qū)人口基數(shù)較大，尚未發(fā)現(xiàn)較可靠的胃癌易感基因。因此，挖掘中東亞人群的胃癌易感基因可為其診斷和治療提供新的依據(jù)。

本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫對(duì)中東亞人群的胃癌差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，根據(jù)已獲得的差異基因的P值大小及基因的表達(dá)量差異倍數(shù)等數(shù)據(jù)，分析各基因與胃癌的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，差異基因所涉及的信號(hào)通路中的p53信號(hào)通路可能與胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)，多種基因通過其發(fā)揮作用，而細(xì)胞周期則與患者的預(yù)后及病理類型存在較強(qiáng)的相關(guān)性,本研究結(jié)果與國(guó)外研究一致[3-5]。

通過STRING對(duì)差異表達(dá)基因的蛋白相互作用進(jìn)行分析，結(jié)果表明，共有12個(gè)差異表達(dá)基因存在蛋白之間的相互作用，且其在2個(gè)數(shù)據(jù)集中均成上調(diào)趨勢(shì)。CKS2屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶亞基家族成員，TANAKA等[6]認(rèn)為CKS2是胃癌相關(guān)基因之一，與胃癌的生物學(xué)侵襲性及預(yù)后相關(guān)，與本研究結(jié)果類似。此外高水平的CKS2與組織學(xué)腫瘤分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期及病理分級(jí)高度相關(guān)，這可能是因?yàn)镃KS2提高了細(xì)胞生長(zhǎng)速度[7]。近年來，有研究表明，胃癌患者上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2(ECT2)與肺癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥密切相關(guān)，其在胃癌患者水平升高可能是由于組織表達(dá)增加或腫瘤細(xì)胞過度周轉(zhuǎn)，導(dǎo)致大量的ECT2進(jìn)入血液循環(huán)所致[8-10]。TERASHIMA等[11]的研究表明，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TOP2A)主要參與DNA合成和細(xì)胞增殖，且較易引起血源性復(fù)發(fā)(HR=2.353)，因此，其可能與胃癌的治療和預(yù)后有著密切的聯(lián)系，為胃癌的治療提供了新靶點(diǎn)。LI等[12]在GEO數(shù)據(jù)庫中對(duì)胃癌易感基因進(jìn)行了挖掘，同時(shí)用PCR方法驗(yàn)證，結(jié)果表明，TOP2A是胃癌的明顯靶向基因，與本研究結(jié)果一致。Xklp2的靶向蛋白(TPX2)，又名限制性表達(dá)的增殖相關(guān)蛋白，它出現(xiàn)在細(xì)胞周期的G1和S期之間，在細(xì)胞分裂完成后消失[13]。LIANG等[14]研究認(rèn)為TPX2過表達(dá)與整體生存率呈低相關(guān)關(guān)系(P=0.004)，且與復(fù)發(fā)時(shí)間間隔有關(guān)(P=0.013)，這可能與TPX2是正常雙極紡錘體形成和正常細(xì)胞分裂所必需的蛋白有關(guān)，由此導(dǎo)致胃癌腫瘤細(xì)胞過度增殖。大盤相關(guān)蛋白5(DLGAP5)是DLGAPS家族成員之一，LIU等[15]在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫對(duì)DLGAP進(jìn)行了研究，并對(duì)其在胃癌組織的表達(dá)通過PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，相對(duì)于正常的胃組織，DLGAP4和DLGAP5在胃癌組織中表達(dá)量明顯增加(P<0.000 1)，與本研究結(jié)果一致。

KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析顯示，細(xì)胞周期通路中的成員CCNB1、CCNB2及CDC6與胃癌的發(fā)病密切相關(guān)，這也存在于差異基因的蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)中。CCNB2可與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的Ⅱ型受體結(jié)合，因此，CCNB2可能在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β介導(dǎo)的細(xì)胞周期控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞中CCNB1的穩(wěn)定或沉默可能會(huì)增加對(duì)紫杉醇的敏感性，并導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)停滯[17]。細(xì)胞分裂周期6蛋白質(zhì)(CDC6)可參與細(xì)胞更新，其可能通過作用于細(xì)胞的增殖指數(shù)來影響胃癌預(yù)后[18]。

有研究表明，PDZ綁定激酶(PBK)的敲除對(duì)胃癌細(xì)胞增殖無影響，但可抑制其侵襲[19]。PBK/TOPK主要通過與p53和PI3K/AKT通路相關(guān)的分子機(jī)制致癌，在p53-DO7陰性組中，腫瘤中PBK/TOPK表達(dá)陽性的患者比那些腫瘤中無PBK/TOPK表達(dá)的患者存活率明顯下降，這可能是胃癌潛在的治療靶點(diǎn)[20]。核糖核苷酸還原酶M2亞基(RRM2)嚴(yán)格控制細(xì)胞周期中核苷酸還原酶的活性，對(duì)其進(jìn)行的功能學(xué)研究表明，RRM2特異性siRNA的下調(diào)，可能會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞在體外和體內(nèi)生長(zhǎng)，降低侵襲性，并抑制其致癌特性[21]。細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白2(CKAP2)與細(xì)胞的增殖活性有關(guān)，KIM等[22]對(duì)其與胃癌的相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，CKAP2在T1或T2男性患者亞組中表達(dá)顯著(P=0.001)，而在其他亞組患者中不存在異常表達(dá)，這可能與男女的生理、激素水平及晚期細(xì)胞侵襲有一定關(guān)系。

本研究得到的存在于蛋白之間相互作用的11個(gè)差異基因與以往研究結(jié)果具有一致性，進(jìn)一步證明了篩選得到的差異基因具有較明顯的可信性。而LU等[23]研究認(rèn)為ARHGAP11A可能為肝癌轉(zhuǎn)移信號(hào)軸的組成部分，此外，還有研究表明，其主要通過細(xì)胞周期中的亞細(xì)胞定位導(dǎo)致乳腺癌，該基因在癌細(xì)胞中的表達(dá)抑制了rhoa依賴機(jī)制，如應(yīng)力纖維形成和局灶性黏附，使細(xì)胞更容易遷移[24-25]，但目前尚無其與胃癌關(guān)系的研究，這為胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新思路。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中GSE56807及GSE63089 2個(gè)中東亞人群數(shù)據(jù)集進(jìn)行胃癌易感基因的挖掘，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARHGAP11A基因可能與胃癌有一定的關(guān)系，這為中東亞人群胃癌的病因和治療方面提供了新方向。