劉洪林，曾藝濤，趙欣

1(重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，功能性食品研發(fā)重慶市工程實驗室，重慶 400067) 2(重慶市輔仁中學，重慶 400067)

普洱茶是一類后發(fā)酵茶，通常被壓縮成餅狀，根據(jù)加工工藝和質(zhì)量特點分為2種：生普洱茶(生普)和成熟的普洱茶(熟普)。20世紀70年代，人們?yōu)榱嗽诙虝r間內(nèi)(幾個月)將普洱茶做成成熟的普洱(幾年)的味道，利用人工發(fā)酵加工工藝做成了熟普。這2種品種都適合老化，因此市場上普洱茶既有陳年生普洱茶又有熟普[1-2]。普洱茶是6大茶類當中的黑茶，是一種被廣泛認可和食用的飲料，可根據(jù)不同的加工條件、特殊的感官特點及其化學成分分為兩類：生普和熟普。陳年生普(以下簡稱APT)價格高昂，和熟普(以下簡稱YPT)的價格大相徑庭，因此對于陳年生普和熟普鑒別是非常重要的。APT經(jīng)歷了自然發(fā)酵過程，在室溫和正常的濕度條件下，進行微生物后發(fā)酵，其在消費前有很長的存儲時間(長達幾十年)[3-4]。YPT是由人工加速發(fā)酵的過程被稱為“渥堆”，茶葉在較大的濕度，較高的溫度(40～60 ℃)，進行為期1～2個月發(fā)酵即可[5-6]。在這種情況下，氧化的速度和程度比APT高，因此，與APT相比，YPT中的所有兒茶素類物質(zhì)都顯著減少[7-8]。

由于其感官品質(zhì)和社會文化因素，普洱茶的知名度越來越高，由于其具有較強的抗氧化活性[9-11]和降脂效果[10,12-13]，被國外認為是奢侈品和有助于健康的“超級食物”。研究表明，普洱茶對膽固醇的合成具有抑制作用，能增加高密度脂蛋白膽固醇含量，降低低密度脂蛋白膽固醇含量，而其他茶類對2種膽固醇含量都會降低[14-15]。同時有研究表明，六大茶類中，普洱茶的減肥效果僅次于烏龍茶[16]。

茶葉總多酚(TPC)是茶葉中所含的一類多羥基類化合物，主要化學成分為兒茶素類(黃烷醇類)、黃酮及黃酮醇類、花青素類、酚酸及縮酚酸類、聚合酚類等化合物的復合體[17-18]。研究表明，茶多酚活性物質(zhì)具解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質(zhì)侵入骨髓，并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫(yī)學界譽為“輻射克星”[19]。兒茶素類具有明顯的酚的特性，占茶葉干重的 12%～24%，約占茶多酚含量的75%～80%，也是茶的苦澀味的來源之一[20]。其中主要成分有表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，其中EGCG含量最為豐富，占兒茶素總量的60%～80%[20]。研究表明，兒茶素類化合物具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗突變、預防心血管疾病等多種作用[21]。

目前，對于綠茶和紅茶的總多酚和黃烷醇類物質(zhì)進行了大量的研究[22]，但普洱茶尤其是APT和YPT的TPC和黃烷醇類化合物及其轉(zhuǎn)化還沒有得到全面的描述。為了了解主要化合物的差異，本文對APT和YPT的TPC和黃烷醇類物質(zhì)活性成分進行分析，以達到對市場上普洱茶商品的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素(GC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)，德國PhytoLab GmbHKG公司；乙腈、水、甲酸(LC-MS級)、福林酚試劑和無水碳酸鈉，美國sigma公司。所有標準品純度≥98%，用甲醇配制成1 mg/mL的標準母液，在-20 ℃下儲存。分別吸取各標準母液混合，用甲醇稀釋至0.01～0.4 mg/L系列混合標準溶液。

MM301型球磨機，德國Retsh公司；BT125D型精密電子分析天平，賽多利斯生產(chǎn)公司；2100 型可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；DK-98-1型雙列四孔電熱恒溫水浴鍋；LC-MS6120系列G6100液質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技股份有限公司。

在云南的不同生產(chǎn)企業(yè)中抽取茶葉樣品：陳年生普：7個(5個2006年產(chǎn)樣、1個1981年產(chǎn)樣和1個1993年產(chǎn)樣)；熟普：12個(5個2017年產(chǎn)樣、5個2016年產(chǎn)樣、1個1981年產(chǎn)樣和1個1995年產(chǎn)樣)。所有樣品均儲存在密閉、干燥和黑暗的條件下，具體見表1。

表1 普洱茶品種、產(chǎn)地和生產(chǎn)年份Table 1 Variety, year of production and region of origin of the puer samples

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備方法

進行測定前，用球磨機對茶葉樣品進行粉碎處理。稱取1 g粉碎樣品加入4 mL體積分數(shù)50%的乙醇溶液在60 ℃水浴中振蕩提取10 min，提取3次，經(jīng) 0.45 μm濾膜過濾，將此茶多酚浸提液定容至25 mL，待用[23]。

1.2.2 LC-DAD-ESI-MS分析方法

質(zhì)譜條件：本實驗采用電噴霧電離質(zhì)譜正離子掃描模式，設置參數(shù)如下：毛細管電壓3 kV，樣品錐電壓20 V，萃取錐電壓3 V，射頻透鏡電壓0.3 V，脫溶劑氣流量650 L/h，去溶劑溫度275 ℃，源溫度為100 ℃。

色譜條件：色譜柱，Eclipse XDB-C18柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)。流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的94.9%乙腈溶液。采用梯度洗脫，0～5 min 3%流動相B，5～8 min 3%～6%流動相B，8～20 min 6%～11%流動相B，20～25 min 11%～12% 流動相B，25～32 min 12%～17%流動相B，32～38 min 17%～20%流動相B，38～44 min 20%～28%流動相B，44～47 min 28%～31%流動相B，47～51 min 31%～38%流動相B，51～54 min 38%～45%流動相B，54～58 min 45%～50%流動相B，58～61 min 50%～90%流動相B，61～63 min 90%流動相B，63～64 min 90%～1%流動相B。流速為0.25 mL/min，柱溫為38 ℃， 進樣器溫度為10 ℃，進樣量5 μL。

1.2.3 總多酚(TPC)測定方法

取茶多酚浸提液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入 0.2 mL 25%福林酚試劑搖勻，反應 3 min后，加入 0.4 mL 20% Na2CO3溶液，加0.4 mL水搖勻。室溫下放置 120 min。用 10 mm比色皿，在 750 nm波長條件下，以水作空白對照，測定吸光度。

標準曲線制備：利用質(zhì)量濃度分別 10、20、30、40、50 mg/L 的沒食子酸(GA)標準溶液按上述測定方法制定標準曲線，進行線性擬合，得茶多酚濃度x與吸光度y的回歸方程：y=19.41x-0.046 7，R2=0.999 6。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用單因素方差分析和最小顯著性差異(least significant difference, LSD)多重比較、t檢驗等比較TPC和黃烷醇類化合物含量在APT和YPT中的差異。采用主成分分析法(PCA)和層次聚類分析(HCA)對APT和YPT進行判別。上述統(tǒng)計分析采用SPSS 23.0軟件。所有實驗數(shù)據(jù)均重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃烷醇類活性成分識別結(jié)果

試驗對APT和YPT茶葉提取液總多酚和黃烷醇類活性成分進行測定，使其多酚類物質(zhì)得到定性和定量分析。由表2得知，利用LC-DAD-ESI-MS分析方法確定了8種黃烷醇類化合物成分，分別是兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素(GC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和兒茶素沒食子酸酯(CG)。表2詳述8種物質(zhì)的保留時間、吸光度光譜和質(zhì)量分裂模式(圖1)。

表2 質(zhì)譜分析結(jié)果Table 2 Mass spectrometric identification results

圖1 普洱茶的LC色譜圖(峰對應表2中的化合物)Fig.1 LC chromatograms of Pu’er Tea

由表3可知，2種茶的TPC和黃烷醇類化合物含量具有顯著差異(P<0.01)。同時可以看出，不同年份的普洱茶中TPC含量差異性顯著，且年份相差越大，差異越顯著。不同產(chǎn)地的普洱茶中TPC含量差異不顯著，這可能是由于加工條件、環(huán)境控制(溫度、濕度和氧氣濃度等)等不同造成的。APT中TPC含量均顯著高于YPT中，其中YPT中TPC含量為(90±1)～(118±1) mg/g，APT中TPC含量為(184±3)～(231±7) mg/g。

茶葉活性成分中含量最高的物質(zhì)為黃烷醇類化合物，在APT中含量依次為ECG>EGCG>EC>EGC>GCG>GC>C>CG，YPT中含量依次為ECG>GC>EC>EGCG>EGC>C>GCG>CG，具體見表3。

表3 APT和YPT的黃烷醇類化合物成分含量 單位：mg/g

注：均值差的顯著性水平為0.01。

可以看出，APT樣品中的GC含量與YPT樣品中相比較，差異顯著性不明顯(部分樣品間差異顯著，部分不顯著)。APT中其余黃烷醇類化合物含量均顯著高于YPT中，ECG和EGCG的含量差異最顯著。同時可以看出，不同產(chǎn)地的普洱茶的黃烷醇類化合物含量的差異不顯著，不同年份差異顯著。有研究表明，普洱茶在發(fā)酵過程中，其黃烷醇類化合物會被氧化并凝聚成如茶黃素、茶紅素等酚類化合物，導致茶葉的顏色變暗，且發(fā)酵時間越長，澀味越低[24]。ZHANG等對APT和YPT的化學成分研究表明，在APT中EGCG、C、EC、EGC、GCG和ECG的含量均顯著高于YPT(P<0.01)；同時APT中含量為：ECG(9.86 mg/g)>EGCG(9.43 mg/g)>EC(6.01 mg/g)>EGC(5.00 mg/g)>GC(3.64 mg/g)> C(3.16 mg/g)> GCG (1.37 mg/g)[25]。這與本試驗研究結(jié)果一致。

ECG是茶葉中主要的兒茶素，約占總量的1/3[26]。本試驗中2種茶中含量最高的黃烷醇類化合物均為ECG，從表中得知，APT中ECG含量為(22.75±0.48)～(45.33±1.29) mg/g，YPT中含量(1.36±0.05)～(3.02±0.04) mg/g，APT中ECG含量顯著高于YPT中。有研究表明，APT中ECG含量也顯著高于其他茶類；APT中的ECG含量高達(30.60±4.18) mg/g，綠茶中含量為(17.10±3.34) mg/g，黃茶中含量為(16.23±7.01) mg/g，白茶中含量為(8.12±3.05) mg/g，烏龍茶中含量為(5.09±1.64) mg/g，紅茶中含量為(2.65±2.25) mg/g和YPT中含量為(1.57±2.46) mg/g[8]。另外，YPT中較高的GC含量可以通過EGCG轉(zhuǎn)化為EGC再進一步轉(zhuǎn)化為GC來解釋[27]。

從表3可知，1981年和1993年生產(chǎn)的APT以及1981年和1995年生產(chǎn)的YPT活性成分TPC和黃烷醇類化合物含量，分別與近幾年生產(chǎn)的生普和YPT成分含量有差異。隨老化時間的延長能否提高普洱茶的質(zhì)量需再做研究。不過，滋味的爽口度隨老化時間延長而增加，是由于典型的苦澀和收斂性化學成分的持續(xù)減少所致?？偠灾?，不同的加工方法導致了APT和YTP中TPC和黃烷醇類化合物活性成分含量不同，APT中含量較高。APT是比較傳統(tǒng)的加工工藝，不經(jīng)過人工發(fā)酵，靠時間和歲月的流逝，自然發(fā)酵，一般5～10年的茶才好喝。YPT在溫暖潮濕的環(huán)境下經(jīng)過渥堆發(fā)酵[25]。

2.2 PCA和HCA分析結(jié)果

主成分得分圖反應樣品與品質(zhì)成分之間的關(guān)系[28]，因PC1解釋了總方差的85.10%， PC2解釋了總方差的10.60%，第1主成分和第2主成分可解釋APT和YPT總多酚和黃烷醇類成分總方差的95.70%，可解釋很大部分變異。故根據(jù)PC 1和PC 2分別繪制載荷樣品分布圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2 主成分分析結(jié)果Fig.2 pca results

APT和YPT樣品在PC1、PC2的分值圖上有很好的聚類趨勢，其中APT樣品分布于第Ⅰ和Ⅳ象限；YPT樣品分布于第Ⅱ和第Ⅲ象限。因此，經(jīng)過檢驗的19個茶葉樣品可以清楚地分成2組：YPT和APT。同時可以看出，YPT和APT的區(qū)分主要是在第1個主成分PC1。APT樣本的特征是除了GC，其余所有化合物的含量均高于YPT。GC在第2個主成分PC2上貢獻更大，這并沒有導致這2種類型茶的分類。PCA結(jié)果表明，不同生產(chǎn)年份和產(chǎn)地的茶葉樣品，沒有影響APT和YPT茶葉類型的分類。根據(jù)主成分分析的結(jié)果，對2個主成分的成分采用組間聯(lián)接(between-groups linkage)的聚類方法和平方歐式距離(squared euclidean distance)區(qū)間測量法進行聚類分析如圖3。

圖3 HCA樹狀圖Fig.3 Heat map of hierarchical clustering dendrogram

結(jié)果顯示：聚類結(jié)果與主成分得分圖結(jié)果基本一致，可以看出樣品可聚為2大類:第一類即APT(13～19號茶樣)，其特征在于TPC和8種黃烷醇類化合物含量較高。第二類YPT(1～12號茶樣)，TPC和8種黃烷醇類化合物含量比較低。其原因在于，TPC和黃烷醇類化合物在普洱茶的發(fā)酵過程中會發(fā)生一系列的氧化、聚和、縮合反應，產(chǎn)生大量的水溶性氧化產(chǎn)物，致使含量會逐漸降低。研究表明，YPT中多酚類物質(zhì)更易被氧化降解，含量更低[6]。

3 結(jié)論

本文對APT和YPT茶葉提取液TPC和黃烷醇類化合物活性成分進行了測定和分析。利用LC-DAD-ESI-MS分析方法對其確定了8種黃烷醇類化合物成分，2種茶的GC含量差異不顯著，APT中TPC和其余7種(GC除外)黃烷醇類化合物含量顯著高于YPT中。APT中含量依次為ECG>EGCG>EC>EGC>GCG>GC>C>CG，YPT中含量依次為ECG>GC>EC>EGCG>EGC>C>GCG>CG，其中2種茶中ECG和EGCG的含量差異最顯著。同時可以看出，不同產(chǎn)地普洱茶的TPC和8種黃烷醇類化合物含量的差異不顯著，不同年份差異顯著。

主成分分析(PCA)和聚類分析(HCA)的方法在茶樹資源篩選中應用越來越普遍[4,6,22-26]，對19個供試樣的TPC和8種黃烷醇類化合物進行主成分分析和聚類分析，由主成分分析結(jié)果可知，19個茶樣主成分分析主要得到2個主成分，累積貢獻率達95.70%。通過聚類分析結(jié)果表明，19個茶樣依據(jù)成分分為2大類。第Ⅰ類包括1～12號，即YPT樣品；第Ⅱ類為13～19號，即APT樣品?？梢奝CA和HCA依據(jù)TPC和8種黃烷醇類化合物能將APT和YPT很好的聚類，成功區(qū)分出APT和YPT樣品；TPC和7種(GC除外)黃烷醇類化合物均是很好的聚類化學標記。PCA和HCA的統(tǒng)計組合可被用作區(qū)分APT和YPT品種和確定特征化合物的適當方法。

普洱茶有較高的藥用價值和營養(yǎng)價值，發(fā)酵作為一種古老的技術(shù)，有助于改善生物活性化合物的生物可及性，并改善它們與健康相關(guān)的功能?？偟膩碚f，本研究為APT和YPT中黃烷醇類活性成分提供了確切信息，可以作為消費者購買普洱茶的參考，對其質(zhì)量監(jiān)督起重要作用。未來的研究可以專注于開發(fā)快速跟蹤分析各種普洱茶特定生物活性化合物與質(zhì)量之間的相關(guān)性。此外，這種研究方法也可用于類似的多元因素代表的產(chǎn)品的質(zhì)量鑒定。目前，不同茶葉品種的認證和表征方法是熱點，依據(jù)活性化合物的含量區(qū)分不同品種的茶葉越來越重要。