周靜，田風(fēng)玉，焦必寧*，何悅*

1(西南大學(xué)，柑桔研究所，重慶，400712) 2(農(nóng)業(yè)部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶，400712)

食源性致病菌的檢測(cè)是食品安全研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題[1]。食源性致病菌引發(fā)的傳染性疾病逐年增加，給人類健康和全球經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的威脅[2]。2017年，CDC’s Foodborne Diseases Active Surveillance Network(FoodNet)報(bào)告中指出，在美國(guó)由食源性致病菌引發(fā)的傳染性疾病造成了24 484例感染，5 677例住院治療和122例死亡[3]。與前3年相比，2017年感染彎曲桿菌、李斯特菌、大腸桿菌的機(jī)率有所增加。近十年來，通過食物傳播的食源性致病菌感染率基本保持不變。雖然情況有所好轉(zhuǎn)，但是食源性致病菌引發(fā)的傳染性疾病依然是發(fā)病率和死亡率逐步攀升最主要的原因之一。許多食源性致病菌具有非常低的感染劑量，例如，E.coliO157:H7和沙門氏菌的感染劑量低至10個(gè)細(xì)胞[4]。因此，建立一種快速、可靠、操作簡(jiǎn)單、易攜帶、高靈敏性、高特異性的檢測(cè)方法，對(duì)于食源性致病菌的實(shí)時(shí)監(jiān)控有著重要的意義。目前應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)方法主要有平板培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法等。這些方法雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但也存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、勞動(dòng)力消耗大、靈敏度低等缺點(diǎn)，從而在食源性疾病爆發(fā)時(shí)，無法滿足快速準(zhǔn)確檢測(cè)的需求。

近年來，基于納米材料的食源性致病菌檢測(cè)方法不斷推陳出新。納米材料指在三維空間中，有一維或多維在納米尺度(1～100 nm)范圍內(nèi)的材料，或由其作為基本單元構(gòu)成的材料[5]。目前研究者已構(gòu)建了多種基于納米材料檢測(cè)食源性致病菌的技術(shù)，如熒光檢測(cè)技術(shù)、可視化比色檢測(cè)技術(shù)、電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)等。其中因可視化比色檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、便攜、低成本和可裸眼快速直接讀出等優(yōu)點(diǎn)而顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。例如，部分納米材料除具有獨(dú)特的光學(xué)和電子特性[[7]，自身還具有類似生物酶的催化活性，這類納米材料被稱為納米酶[8]。這些納米酶可以將過氧化氫(H2O2)的O—O鍵分解為具有高氧化能力的羥基自由基[9]，羥基自由基能氧化過氧化物酶底物，如3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine, TMB)、3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)和鄰苯二胺(o-phenylenediamine dihydrochloride, OPD)，分別生成藍(lán)色、綠色和黃色的氧化產(chǎn)物[10]。納米酶的出現(xiàn)，為新型可視化比色檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)提供了更多機(jī)會(huì)[11]。此外，一些納米材料的表觀顏色在其表面性質(zhì)發(fā)生改變后會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，從而可用于構(gòu)建可視化比色檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的定量檢測(cè)[12]。還有一些自身顏色鮮艷的納米材料，可直接用于目標(biāo)菌的可視化比色檢測(cè)。本文綜述了近幾年基于納米材料所構(gòu)建的可視化比色檢測(cè)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期對(duì)新的可視化比色技術(shù)的開發(fā)提供思路。

1 基于納米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用研究(表1)

1.1 基于納米酶的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

納米酶是指一類本身具有類似天然酶催化活性的無機(jī)納米材料[13]，與天然酶相比，它具有制備工藝成熟、成本低、易于貯存等優(yōu)勢(shì)[14]。組成納米酶的材料主要包括：貴金屬納米材料、金屬氧化物以及復(fù)合納米材料。納米酶的出現(xiàn)，為新型比色傳感器的開發(fā)提供了更多機(jī)會(huì)。2007年，GAO等[15]首次發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米粒子具有類似過氧化物酶的特性。后來的研究者們相繼發(fā)現(xiàn)貴金屬納米顆粒如金納米顆粒(gold nanoparticles， Au NPs)[11, 16]、金屬有機(jī)框架(metal organic frameworks， MOFs)納米材料如Cu-MOF[17]、金屬氧化物納米材料如氧化鎳納米顆粒(NiO NPs)[18]等都具有類似天然酶的活性。

1.1.1 基于貴金屬納米酶的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

貴金屬納米材料的性質(zhì)十分穩(wěn)定，部分貴金屬納米材料還具有類似過氧化物酶的催化特性，其催化活性主要是通過表面吸附和快速電子轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)的[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Au NPs、鉑納米顆粒(Pt NPs)、鈀納米顆粒(Pd NPs)[20]以及由它們構(gòu)成的雙金屬?gòu)?fù)合納米材料，如Au@Pt NPs[16]、Ag@(Pd、Au、Pt) NPs[21]等都具有類似過氧化物酶的催化活性。JIANG等[11]將金黃色葡萄球菌的抗體修飾到Au@Pt NPs表面，結(jié)合免疫層析技術(shù)，開發(fā)了一種新型的可視化比色檢測(cè)技術(shù)。當(dāng)金黃色葡萄球菌存在時(shí)，檢測(cè)線上固定的抗體可以特異性地捕獲目標(biāo)菌，目標(biāo)菌再結(jié)合抗體修飾的Au@Pt NPs，形成雙夾心復(fù)合物。此時(shí)，Au@Pt NPs在H2O2存在的條件下，催化TMB氧化顯色，根據(jù)體系內(nèi)比色信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)。該技術(shù)的檢測(cè)限為100 CFU/mL。SU等[16]也利用Au@Pt NPs實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的定量檢測(cè)，并且進(jìn)一步提高了基于雙金屬納米材料可視化比色檢測(cè)技術(shù)的靈敏度。他們以Au NPs為模板孵育生長(zhǎng)Pt NPs，在制備過程中，加入具有保護(hù)和穩(wěn)定作用的陽離子表面活性劑十六烷基三甲基氯化銨(hexadecyltrimethyl ammonium chloride, CTAC)和能靶向識(shí)別E.coliO157∶H7的4-巰基苯硼酸(4-mercaptophenylboronic acid,MPBA)分子，得到MPBA-CTAC-Au@Pt NPs。通過MBPA上的硼酸與細(xì)菌表面糖類中所含的順式二醇基團(tuán)相互作用，MPBA-CTAC-Au@Pt NPs可有效結(jié)合在E.coliO157∶H7表面。加入H2O2，MPBA-CTAC-Au@Pt NPs能催化H2O2氧化TMB顯色。該技術(shù)在E.coliO157∶H7濃度為7～6×106CFU/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限低至7 CFU/mL。此外，WU等[22]用適配體修飾的磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles， MNPs)和該致病菌的抗體(Ab)夾心捕獲致病菌，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)和二抗(AAb)雙重修飾的Au NPs復(fù)合酶，得到MNPs-細(xì)菌-Ab-AAb-Au NPs-HRP復(fù)合物，該復(fù)合物上的HRP可催化H2O2氧化TMB顯色，從而實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的可視化比色檢測(cè)。該技術(shù)的檢測(cè)范圍為1×103～1×108CFU/mL，檢測(cè)限為103CFU/mL，相比僅使用HRP催化的ELISA法，其靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，并且具有更寬的檢測(cè)范圍。

1.1.2 基于有機(jī)金屬框架納米酶的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

基于貴金屬納米酶開發(fā)的可視化比色檢測(cè)技術(shù)，雖然顯示出良好的分析性能，但是貴金屬材料價(jià)格昂貴，且易受到樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，限制了其應(yīng)用范圍。通過普通金屬離子和有機(jī)交聯(lián)劑自組裝形成的MOFs材料，由于其表面積大、孔隙率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)受到了研究者們的廣泛關(guān)注[17]。近來研究發(fā)現(xiàn)，MOFs材料具有類似過氧化物酶的催化活性，能夠在H2O2存在條件下，催化TMB氧化顯色。WANG等[17]利用適配體修飾的Cu-MOF材料作為信號(hào)探針，適配體修飾的磁性納米顆粒作為捕獲探針，通過簡(jiǎn)單的磁分離，可以一步實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的捕獲和識(shí)別。該技術(shù)在50～104CFU/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為20 CFU/mL。

1.1.3 基于金屬氧化物納米酶的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

金屬氧化物納米酶通常由過渡金屬氧化物納米材料構(gòu)成，此類納米酶和反應(yīng)底物結(jié)合通常伴隨著電子轉(zhuǎn)移和化合價(jià)的變化[23]。常見的金屬氧化物納米酶有：NiO, CeO2, Co3O4, ZnFe2O4等。金屬氧化物納米酶不但穩(wěn)定性好，而且制備過程簡(jiǎn)單、成本低，常用于致病菌的可視化比色檢測(cè)。PANDIAN等[18]首先將Ni NPs煅燒氧化生成NiO NPs，再通過檸檬酸(citric acid, CA)的修飾，得到CA包被的NiO NPs(CA-NiO NPs)；隨后在CA-NiO NPs表面修飾鼠傷寒沙門氏菌的Ab，得到能夠特異性識(shí)別鼠傷寒沙門氏菌的Ab-CA-NiO NPs復(fù)合物。一方面，NiO NPs在酸性條件下可催化H2O2氧化TMB顯色[10]；另一方面，結(jié)合在細(xì)菌表面的NiO NPs可吸收激光的能量，通過光熱作用達(dá)到對(duì)目標(biāo)菌靶向殺滅的目的。該技術(shù)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌檢測(cè)的線性范圍為10～106CFU/mL，檢測(cè)限為10 CFU/mL，在牛奶和果汁中的加標(biāo)回收率分別為95%～100% 和 92%～99%，滿足檢測(cè)的要求。

此外，由于部分金屬氧化物納米酶的催化活性低，難以在獨(dú)立存在的情況下發(fā)揮作用，故一般利用碳基納米材料充當(dāng)載體以改善金屬氧化物納米酶的催化活性。如：ZnFe2O4因具有良好的穩(wěn)定性和低成本而備受關(guān)注，但是裸的ZnFe2O4催化活性較低[24]。采用具有大的比表面積的碳基納米材料,如還原型氧化石墨烯(reducedgraphemeoxide, rGO)對(duì)其進(jìn)行載負(fù)，因ZnFe2O4和rGO之間具有協(xié)同效應(yīng)，可有效提高其催化活性。WU等[14]利用該技術(shù)制備了具有高效催化性能的ZnFe2O4/rGO復(fù)合納米材料，并構(gòu)建了可視化比色適配體檢測(cè)技術(shù)，用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)。他們首先在微孔板上修飾能特異性識(shí)別鼠傷寒沙門氏菌的適配體1分子，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜環(huán)境中目標(biāo)致病菌的準(zhǔn)確捕獲和分離；然后在ZnFe2O4/rGO表面修飾能特異性識(shí)別鼠傷寒沙門氏菌的適配體2分子，利用夾心策略，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的可視化比色檢測(cè)。該技術(shù)的檢測(cè)限為11 CFU/mL，具有較高的靈敏度。

1.2 基于納米材料表觀顏色變化的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

1.2.1 基于納米金表觀顏色變化的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

Au NPs由于制備過程簡(jiǎn)單，粒徑大小可控，生物相容性好，具有獨(dú)特的物理、化學(xué)性質(zhì)，使得基于Au NPs的表面等離子共振效應(yīng)所建立的可視化比色檢測(cè)技術(shù)在食品安全分析領(lǐng)域得到很大發(fā)展[25]。在混合基質(zhì)中，分散態(tài)的Au NPs呈紅色，通過靜電作用或者靶向連接作用促使Au NPs發(fā)生團(tuán)聚，其表面等離子共振吸收峰也會(huì)發(fā)生明顯地移動(dòng)[26]。通過適當(dāng)引入生物識(shí)別元素來調(diào)控Au NPs的“分散/聚集”狀態(tài)，即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的可視化比色檢測(cè)[27]。ZHENG等[28]將酪氨(tyramine, TYR)修飾到Au NPs的表面，由于HRP可催化H2O2氧化TYR，從而引起TYR修飾的Au NPs發(fā)生團(tuán)聚?；诖?，構(gòu)建可視化比色檢測(cè)技術(shù)用于大腸桿菌的快速靈敏檢測(cè)。他們首先將捕獲抗體(CAb)修飾在磁性納米顆粒(MNPs)表面得到捕獲探針CAb-MNPs；再將檢測(cè)抗體(DAb)和過氧化氫酶(CAT)修飾到聚苯乙烯微球表面，得到檢測(cè)探針DAb-PS-CAT。將CAb-MNPs、DAb-PS-CAT與目標(biāo)菌樣品溶液混合，通過抗原-抗體的特異性識(shí)別作用得到MNPs-細(xì)菌-PS-CAT復(fù)合物，利用磁分離富集大腸桿菌。MNPs-細(xì)菌-PS-CAT復(fù)合物中的CAT可催化H2O2分解生成H2O，溶液中H2O2的減少導(dǎo)致HRP的催化反應(yīng)無法進(jìn)行，此時(shí)溶液中的Au NPs呈分散狀態(tài)，顯紅色。相反，不存在大腸桿菌時(shí)，該溶液的顏色由于Au NPs的聚集而呈現(xiàn)藍(lán)顏色。該技術(shù)對(duì)目標(biāo)菌檢測(cè)的線性范圍為50～5.0×104CFU/mL，檢測(cè)限為50 CFU/mL。此外，BUI等[29]通過控制納米脂質(zhì)體釋放半胱氨酸，達(dá)到對(duì)Au NPs“聚集/分散”狀態(tài)的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了對(duì)E.coliO157、李斯特菌及沙門氏菌的可視化比色檢測(cè)。一方面，在微孔板上修飾單克隆抗體(monoclonal IgG, MI)，加入目標(biāo)致病菌和多克隆抗體(polyclonal IgG, PI)，得到MI-致病菌-PI復(fù)合物；然后加入生物素化的多克隆二抗(polyclonal anti-IgG, API)和鏈霉親和素(streptavidin, SA)，得到可以調(diào)控脂質(zhì)體釋放半胱氨酸的MI-致病菌-PI-API-Biotin-SA免疫復(fù)合物；另一方面，在包裹有半胱氨酸的納米脂質(zhì)體(Cys-liposomes)表面修飾有生物素(biotin)，通過SA-Biotin連接作用得到MI-致病菌-PI-API-Biotin-SA-Biotin-Cys-liposomes免疫復(fù)合物；最后加入Au NPs和PBST(PBS buffer with Tween-20 0.05%)，PBST可誘導(dǎo)脂質(zhì)體裂解釋放半胱氨酸。半胱氨酸的硫醇基團(tuán)與Au NPs結(jié)合，其游離的氨基和羧基通過分子間氫鍵和其他半胱氨酸分子結(jié)合，從而可以使Au NPs聚集，發(fā)生明顯的顏色變化。該技術(shù)靈敏度較高，可直接檢測(cè)個(gè)位數(shù)的食源性致病菌。另外，SINGH等[30]利用粘菌素作為識(shí)別分子，構(gòu)建了基于Au NPs的可視化比色檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)可直接用于檢測(cè)水中的大腸桿菌。該檢測(cè)體系沒有大腸桿菌時(shí)，陽離子粘菌素通過電荷相互作用與陰離子檸檬酸根修飾的Au NPs結(jié)合,使Au NPs發(fā)生聚集，此時(shí)溶液顯藍(lán)色；該檢測(cè)體系存在大腸桿菌時(shí)，粘菌素特異性結(jié)合大腸桿菌，從而無法促使Au NPs發(fā)生聚集，此時(shí)溶液顯紅色。此技術(shù)對(duì)自來水中的大腸桿菌檢測(cè)限為10 CFU/mL，對(duì)湖水樣品中的大腸桿菌檢測(cè)限為100 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間僅需5 min，且不需要任何昂貴的試劑和儀器設(shè)備。

銀染放大法也經(jīng)常被運(yùn)用到致病菌的可視化比色檢測(cè)中[31]。銀染放大法，即銀離子被還原劑,如對(duì)苯二酚、抗壞血酸(ascorbic acid, AA)、對(duì)氨基苯酚(p-aminophenol, PAP)等還原為零價(jià)銀，沉積在Au NPs或者金納米棒(gold nanorods， Au NRs)表面，可以發(fā)生多種顏色的變化。例如，當(dāng)零價(jià)銀沉積在Au NRs表面時(shí)，Au NRs的縱橫比顯著減小。并且隨著銀染程度的變化，溶液顏色隨之改變[32]。CHEN等[33]首次通過銀染的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的多色檢測(cè)。他們首先利用噬菌體感染大腸桿菌，使其裂解釋放β-半乳糖苷酶；p-半乳糖苷酶催化氨基苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷(p-aminophenyl-β-D-galactopyranoside, PAPG)還原生成PAP；具有還原性的PAP還原銀離子生成金屬銀，金屬銀沉積在Au NRs表面，導(dǎo)致Au NRs的縱橫比發(fā)生顯著改變，從而發(fā)生多種顏色的變化。雖然基于裸眼可視的檢測(cè)限僅為1 × 105CFU/mL，但是人眼對(duì)于多色(大約1 000萬中顏色類型)分辨能力遠(yuǎn)超同色系(大約64級(jí))的分辨力[6, 34]，使得該技術(shù)在可視化比色檢測(cè)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。

Au NPs體積的變化，也可導(dǎo)致光學(xué)信號(hào)的變化[35]。LI等[36]利用抗體修飾的金核特異性結(jié)合空腸彎曲桿菌，通過離心過濾器過濾，去除未結(jié)合空腸彎曲桿菌的金核，最后AA還原氯金酸在金核的表面生成Au NPs，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大。該技術(shù)檢測(cè)限為1.088×103CFU/mL。CAO等[37]設(shè)計(jì)了雙信號(hào)可視化比色檢測(cè)技術(shù)，通過增強(qiáng)檢測(cè)溶液的顏色深度，達(dá)到檢測(cè)空腸彎曲桿菌的目的。他們首先在金核表面修飾抗體，利用AA還原氯金酸在金核表面生成Au NPs，然后對(duì)Au NPs進(jìn)行銀染，進(jìn)一步加深檢測(cè)溶液的顏色深度。該技術(shù)檢測(cè)限為106CFU/mL。此外，SUNG等[38]通過還原四氯金酸增大Au NPs的體積，從而增強(qiáng)樣品溶液的顏色深度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌的可視化比色檢測(cè)。該技術(shù)在牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)包被的MNPs表面共價(jià)修飾Au NPs和金黃色葡萄球菌的Ab得到Ab-Au NPs-BSA-MNPs納米復(fù)合物；隨后該納米復(fù)合物特異性識(shí)別金黃色葡萄球菌，并通過磁分離進(jìn)行多次洗滌富集；然后將金黃色葡萄球菌-Ab-Au NPs-BSA-MNPs復(fù)合物溶液注入到直徑3 mm的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)孔中，通過孔底部的醋酸纖維膜過濾得到該復(fù)合物；最后在PDMS孔中注入四氯金酸和羥胺，以增強(qiáng)檢測(cè)樣品的顏色深度，實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的可視化比色檢測(cè)。該技術(shù)對(duì)于緩沖溶液中的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為1.5×103CFU/mL，對(duì)牛奶中的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為1.5×105CFU/mL。

上述大部分可視化比色檢測(cè)技術(shù)往往需要對(duì)金納米材料進(jìn)行共價(jià)修飾，價(jià)錢昂貴且制備時(shí)間長(zhǎng)，構(gòu)建基于金納米材料的無標(biāo)記可視化比色檢測(cè)技術(shù)會(huì)更為經(jīng)濟(jì)。JUNG等[39-40]利用巰基化的寡核苷酸探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)Au NPs“聚集/分散”的調(diào)控。該技術(shù)以巰基化的寡核苷酸探針為引物，靶DNA分子序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后目標(biāo)序列通過末端的巰基吸附在Au NPs表面，由于擴(kuò)增的長(zhǎng)鏈DNA帶有豐富的負(fù)電荷，在靜電力的作用下，使得空間排斥增強(qiáng)，從而使得Au NPs在鹽誘導(dǎo)下不會(huì)發(fā)生聚集；相反，如果沒有靶DNA分子存在，巰基化的寡核苷酸DNA探針可引起Au NPs的聚集，從而使得顏色由紅色變成藍(lán)色。該技術(shù)可檢測(cè)nM級(jí)別的靶標(biāo)DNA。此外，ROTHBERG等[41]研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA結(jié)合在Au NPs表面時(shí)，可以對(duì)Au NPs起到穩(wěn)定化的作用，保護(hù)Au NPs在鹽誘導(dǎo)下不發(fā)生團(tuán)聚?；诖?，MCVEY等[42]提出了用核酸內(nèi)切酶控制Au NPs聚集的新技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了無標(biāo)記、超靈敏地檢測(cè)致病菌DNA的目的。首先與目標(biāo)菌DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的RNA與Au NPs相互作用，避免Au NPs在鹽誘導(dǎo)下發(fā)生團(tuán)聚，此時(shí)Au NPs溶液呈現(xiàn)紅色；然而，當(dāng)該檢測(cè)體系內(nèi)含有目標(biāo)菌DNA時(shí)，目標(biāo)菌DNA和RNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)形成DNA-RNA異源雙鏈體結(jié)構(gòu)，該雙鏈體對(duì)RNAse H酶促切割敏感，使得目標(biāo)菌DNA被釋放，并進(jìn)入下一輪與RNA進(jìn)行雜交、RNAse H酶切、目標(biāo)菌DNA釋放；最后直到所有RNA都被消耗，使得Au NPs失去保護(hù)，在高鹽環(huán)境中發(fā)生團(tuán)聚，溶液變?yōu)樗{(lán)色。該技術(shù)可以檢測(cè)低至1 pmol/L的目標(biāo)菌DNA，具有超高的靈敏度和特異性。

以上檢測(cè)策略通常需要2個(gè)或多個(gè)步驟完成，操作較繁瑣。并且，多個(gè)步驟在一定程度上會(huì)導(dǎo)致更多的干擾和更多的目標(biāo)致病菌的損失，從而影響檢測(cè)的可靠性[43]?！耙徊綑z測(cè)”由于其免洗滌、簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)，受到了研究人員的重視。LIU等[44]構(gòu)建了雙功能納米探針(CS-Au NPs @ fusion-pVIII)以實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的“一步檢測(cè)”。pVIII融合蛋白(fusion-pVIII)是一種可特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌的蛋白。在EDS/NHS的作用下，pVIII融合蛋白的氨基酸鏈的碳端羧基與Au NPs表面修飾的半胱氨酸(CS)的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)得到CS-Au NPs @ fusion-pVIII雙功能納米探針。在含有目標(biāo)菌的檢測(cè)體系中，由于該納米探針上面的pVIII融合蛋白可迅速結(jié)合目標(biāo)菌，在納米探針的連接作用下Au NPs發(fā)生團(tuán)聚，樣品溶液顏色隨之變淡。反之無目標(biāo)菌存在的時(shí)候，該檢測(cè)溶液呈正紅色。該技術(shù)通過fusion-pVIII對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性識(shí)別能力和CS-Au NPs獨(dú)特的表面等離子共振特性，成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌的可視化比色檢測(cè)體系。30 min內(nèi)可完成檢測(cè)，檢測(cè)限為19 CFU/mL。

1.2.2 基于銀納米顆粒表觀顏色變化的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

相比Au NPs而言，相同粒徑下的銀納米顆粒(Ag NPs)具有更大的消光系數(shù)，有望構(gòu)建更為靈敏的檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)致病菌可視化比色檢測(cè)[45]。同Au NPs相似，通過引入生物識(shí)別元素來調(diào)控Ag NPs的“分散/聚集”狀態(tài)，就能產(chǎn)生顏色的變化。ZHENG等[46]在Ag NPs表面修飾MPBA，用于大腸桿菌的檢測(cè)。MPBA-Ag NPs結(jié)合了目標(biāo)致病菌之后，會(huì)由聚集狀態(tài)變?yōu)榉稚顟B(tài)，并發(fā)生明顯的顏色變化。該技術(shù)在5×104～1×107CFU/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.9×104CFU/mL。由于Ag NPs容易氧化且Ag NPs表面較難修飾所需的識(shí)別分子，故對(duì)基于Ag NPs的可視化比色檢測(cè)技術(shù)的研究并不多，需要進(jìn)一步開發(fā)一些新的修飾策略，以拓展基于Ag NPs可視化比色檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍[47]。

1.2.3 基于聚合物納米粒子表觀顏色變化的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

聚合物納米粒子性能優(yōu)異，可用于開發(fā)可視化比色檢測(cè)技術(shù)。PDA囊泡是一種典型的聚合物納米粒子。聚丁二炔(polydiacetylene, PDA)及其衍生物可以通過自組裝形成PDA囊泡，PDA囊泡由親水頭部和疏水尾部組成，在640 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其顏色為藍(lán)色。在外界溫度、pH、分子識(shí)別等條件的影響下，最大吸光度從640 nm移動(dòng)到540 nm，其顏色由藍(lán)色變?yōu)榧t色[48]。WU等[12]用一種丁二炔的單體—10,12-二十五碳二炔酸(PCDA)制備了納米級(jí)PDA囊泡，并通過共價(jià)偶聯(lián)將截短的脂多糖-適配體修飾在PDA囊泡表面，從而得到修飾了適配體的PDA探針。E.coilO157:H7與囊泡界面處的適配體之間的特異性識(shí)別導(dǎo)致PDA囊泡由藍(lán)色轉(zhuǎn)變成紅色，可直接用裸眼讀出。該技術(shù)在2 h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)104～108CFU/mL大腸桿菌的檢測(cè)，并具有優(yōu)異的特異性。與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法相比，此技術(shù)對(duì)203株臨床糞便標(biāo)本中E.coilO157:H7的檢出率為98.5%，表明該技術(shù)可用于臨床糞便標(biāo)本的檢測(cè)。此外，OLIVEIRA等[49]利用PDA與賴氨酸的相互作用開發(fā)了賴氨酸-PDA囊泡傳感器。具體而言，氨基酸代謝產(chǎn)物可通過間接擾動(dòng)改變PDA構(gòu)象。例如沙門氏菌含有能使賴氨酸脫羧生成胺的賴氨酸脫羧酶，在其培養(yǎng)基中加入賴氨酸，賴氨酸脫羧生成的胺會(huì)造成細(xì)胞外環(huán)境pH的增加，從而誘導(dǎo)PDA囊泡從藍(lán)色轉(zhuǎn)變成紅色。該技術(shù)研究了由賴氨酸脫羧造成的不同酸度對(duì)PDA體系顏色變化的影響，從而證實(shí)了其開發(fā)的賴氨酸-PDA囊泡可以用作比色傳感器的構(gòu)建。由于PDA囊泡獨(dú)特的色彩特性，PDA囊泡在致病菌可視化比色檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒋蠓女惒蔥50]。

1.3 基于有色納米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)

納米酶的催化活性，貴金屬納米材料、聚合物納米材料的表面性質(zhì)，都容易受到外界環(huán)境的干擾。有色納米材料因其色澤鮮艷、易于制備并且抗干擾能力強(qiáng)，而被越來越多的應(yīng)用到致病菌的可視化比色檢測(cè)中。SUN等[51]構(gòu)建了基于藍(lán)色二氧化硅納米顆粒(blue-Si NPs)的可視化比色檢測(cè)技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)雞白痢沙門氏菌(S.pullorum)的檢測(cè)。他們首先采用抗體修飾的MNPs對(duì)致病菌進(jìn)行篩選和預(yù)富集；隨后，加入抗體修飾的blue-Si NPs, blue-Si NPs特異性結(jié)合致病菌，形成MNPs-S.pullorum-blue-Si NPs三明治免疫復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)比色信號(hào)的放大。該技術(shù)靈敏度高，檢測(cè)限為44 CFU/mL。ALAMER等[52]進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，構(gòu)建了基于有色磁珠的可視化比色檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)在羧基化的棉簽上面修飾致病菌的抗體得到捕獲探針，抗體修飾有色磁珠得到信號(hào)探針，通過夾心策略，得到“棉簽-目標(biāo)菌-有色磁珠”三明治免疫復(fù)合物，可檢測(cè)低至10 CFU/mL的目標(biāo)菌。由于該方法僅使用棉簽，就可以收集和檢測(cè)樣品中的致病菌，因此可以利用該方法開發(fā)食源性致病菌快速篩查技術(shù)。此外，SHIN等[53]使用萬古霉素修飾的藍(lán)色聚合物納米珠(blue-colored polymer nanobeads, NB-vanco)檢測(cè)革蘭氏陽性細(xì)菌。萬古霉素能和革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁上的D-丙氨酰-D-丙氨酸亞基發(fā)生多價(jià)特異性相互作用，使得NB-vanco特異性結(jié)合在革蘭氏陽性致病菌表面；與致病菌的連接作用使NB-vanco聚集，然后用多孔過濾膜系統(tǒng)過濾掉未結(jié)合的單細(xì)菌和單珠，得到藍(lán)色聚合物，增強(qiáng)了藍(lán)色信號(hào)。該技術(shù)對(duì)致病菌的檢測(cè)用時(shí)小于30 min，可以實(shí)現(xiàn)多種革蘭氏陽性致病菌的檢測(cè)，具有較強(qiáng)的通用性。上述技術(shù)都不需要核酸提取，細(xì)菌裂解等步驟，將樣品前處理最小化，這種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、輕巧的檢測(cè)平臺(tái)更容易應(yīng)用到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)以及現(xiàn)場(chǎng)疾病診斷中。另外，研究人員直接利用紅色的Au NPs實(shí)現(xiàn)了對(duì)食源性致病菌的可視化比色檢測(cè)。WU等[54]利用多重交叉置換擴(kuò)增技術(shù)(multiple cross displacement amplification, MCDA)和基于Au NPs的側(cè)向?qū)游錾飩鞲衅?lateral flow biosensor, LFB)開發(fā)了一種可快速檢測(cè)單增李斯特菌的新型可視化比色檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)首先提取單增李斯特菌種的DNA，然后以其特異性基因lmo0733為靶標(biāo)，分別以5’端修飾地高辛(digoxigenin， Dig)和5’端修飾Biotin的寡核苷酸序列為交叉引物和擴(kuò)增引物，在61 ℃、20 min的條件下進(jìn)行多重交叉置換，得到了一條兩端分別修飾Dig和Biotin的靶核苷酸鏈；最后進(jìn)行LFB檢測(cè)，LFB檢測(cè)線上固定的抗地高辛抗體(Anti-Dig)能特異性地捕獲靶核苷酸鏈，靶核苷酸鏈另一端的Biotin結(jié)合SA修飾的Au NPs(SA-Au NPs)，形成雙抗夾心復(fù)合物Anti-Dig-靶核苷酸鏈-Au NPs，該復(fù)合物堆疊在檢測(cè)線上，聚集了大量的紅色Au NPs，產(chǎn)生一條紅色條帶。為了控制條帶的正常功能，檢測(cè)線后端控制線上固定的生物素化的牛血清白蛋白也會(huì)和SA-Au NPs結(jié)合，此時(shí)，LFB上面顯示2條紅線為陽性。反之，若不存在靶核苷酸序列，則LFB上面只有1條紅線。該技術(shù)靈敏度較高可檢測(cè)低至10 fg的目標(biāo)致病菌DNA產(chǎn)物，整個(gè)過程可在1 h內(nèi)完成。

此外，SUAIFAN和ALHOGAIL等[55-57]利用食源性致病菌蛋白酶特異性水解多肽的原理設(shè)計(jì)了一種新型可視化比色傳感器。該技術(shù)首先將鍍金的自粘片堆疊在塑料條上面，隨后將表面修飾有特定肽鏈的MNPs通過共價(jià)作用固定在金表面，得到金-多肽-MNPs復(fù)合物，表面呈黑色；然后在復(fù)合物下方2～3 mm的背面固定圓形永磁紙，在目標(biāo)致病菌存在時(shí)，該致病菌產(chǎn)生的蛋白酶可水解相應(yīng)的多肽，使得MNPs脫離鍍金自粘片，從而呈現(xiàn)出金原本的顏色，隨著目標(biāo)致病菌濃度的增大，金的顏色增強(qiáng)，從而達(dá)到對(duì)致病菌可視化比色檢測(cè)的目的。該技術(shù)可以檢測(cè)多種食源性致病菌，對(duì)E.coliO157∶H7的檢測(cè)限為12 CFU/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為7 CFU/mL，對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)限為2.17×102CFU/mL，整個(gè)檢測(cè)過程可在30 s內(nèi)完成。

表1 基于納米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Application of visual colorimetric detection techniques based on nanomaterials in the detection offoodborne pathogenic bacteria

注：NR,未見報(bào)道。

3 總結(jié)與展望

開發(fā)高效、快速、簡(jiǎn)單、靈敏的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)對(duì)保障食品安全具有重要的意義。與傳統(tǒng)方法相比，基于納米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。一些納米材料具有類似過氧化物酶的活性，可催化H2O2氧化TMB、ABTS、OPD生成藍(lán)色、綠色和黃色的氧化產(chǎn)物；一些納米材料，如貴金屬納米粒子、聚合物納米粒子等，在表面性質(zhì)發(fā)生改變后會(huì)發(fā)生相應(yīng)的顏色變化；還有一些自身具有明艷色彩的納米材料，可通過特異性結(jié)合在食源性致病菌的表面實(shí)現(xiàn)比色信號(hào)的放大?；诩{米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建可視化比色檢測(cè)技術(shù)。

隨著基于納米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，還有一些問題需要完善解決。在今后構(gòu)建基于納米材料的可視化比色快檢技術(shù)中，還需要注意以下幾個(gè)問題：

(1)需要進(jìn)一步控制納米材料的大小和形狀，以達(dá)到對(duì)其性能的優(yōu)化。通常減小納米顆粒的尺寸會(huì)增大納米顆粒的比表面積，從而提高納米酶的催化活性；改善納米材料的形狀有利于調(diào)節(jié)納米材料的消光截面，提高納米材料的消光系數(shù)，可優(yōu)化納米材料的比色性能。

(2)生物識(shí)別元素(如：DNA/RNA適配體、抗體、抗生素、噬菌體等)標(biāo)記的納米材料在可視化比色檢測(cè)中運(yùn)用較為普遍，但是這種標(biāo)記方法耗時(shí)耗力，大大降低了方法的實(shí)用性。開發(fā)無標(biāo)記可視化比色檢測(cè)技術(shù)，促使生物受體在納米材料的合成過程中雜交或結(jié)合在納米材料上，將成為未來研發(fā)重點(diǎn)之一。

(3)在食品安全分析中，對(duì)于食源性致病菌的檢測(cè)需要分析方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)是今后的重點(diǎn)研發(fā)方向。因此，簡(jiǎn)單高效的“一步檢測(cè)”將會(huì)愈發(fā)受到研究者們的歡迎。

(4)可視化比色檢測(cè)技術(shù)往往存在靈敏度不夠，無法進(jìn)行痕量分析的缺點(diǎn)。結(jié)合信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)可大大提高可視化比色檢測(cè)技術(shù)的靈敏度。目前的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)包括雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、鏈置換法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、酶切法、級(jí)聯(lián)催化法等。

總之，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于納米材料的可視化比色檢測(cè)技術(shù)將會(huì)朝著更加輕巧、靈敏、高效、特異、低成本的方向發(fā)展，更多地被運(yùn)用到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)當(dāng)中。