韓云飛，翟鈺佳，郭駿飛，楊樂，德力格爾吉日嘎拉，段艷

(內蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010018)

發(fā)酵香腸是指將碎肉和丁狀脂肪同鹽、糖、香辛料等混合灌入腸衣內，經(jīng)微生物發(fā)酵及干燥成熟而制成的肉制品[1]。傳統(tǒng)香腸的自然發(fā)酵完全依靠本身少量的微生物，存在發(fā)酵周期長，產(chǎn)品質量難以保障等缺點，因此逐漸被人工接種發(fā)酵劑所取代。目前常用的肉制品發(fā)酵劑有葡萄球菌、微球菌和乳酸菌[2-3]。葡萄球菌可釋放脂肪酶和蛋白酶，增強肉制品風味，產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶，改善產(chǎn)品色澤[4-6]。JEONG等從豆制發(fā)酵食品中篩選出33株葡萄球菌,大多數(shù)可在4% NaCl的條件下顯示脂肪酶活性[7]。高繼慶等發(fā)現(xiàn)添加了木糖葡萄球菌的魚類，脂肪氧化產(chǎn)物含量增多[8]。乳酸菌具有產(chǎn)酸速度快、耐鹽、抑菌等特點[9-10]，可縮短發(fā)酵周期，提高食品安全性。為滿足發(fā)酵香腸品質、成本、安全性等要求，葡萄球菌和乳酸菌復合發(fā)酵劑的使用越來越多。FIEIRA等將葡萄球菌與乳酸菌作為發(fā)酵劑用于意大利香腸，研究NaCl替代物對發(fā)酵劑的影響[11]，可見葡萄球菌和乳酸菌作為混合發(fā)酵劑的實用性很強。SUN等將葡萄球菌與乳酸桿菌混合用于哈爾濱香腸，發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵劑改善了肉制品品質[12]。

脂肪氧化是發(fā)酵香腸成熟過程中主要的生化反應之一，可將脂肪分解產(chǎn)生的脂肪酸進一步氧化為醛酮等風味物質，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵肉制品60%的風味來源于脂肪分解、氧化[13]。本實驗將從內蒙古傳統(tǒng)肉制品中分離篩選出具有脂肪分解能力的木糖葡萄球菌X21-2m與植物乳桿菌19-2D復配應用于羊肉發(fā)酵香腸，以自然發(fā)酵和漢森發(fā)酵劑作為對照，研究其對羊肉發(fā)酵香腸脂肪氧化和脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原輔料：精選內蒙古市售蘇尼特羊后腿肉和羊尾肥膘。食鹽、蔗糖、葡萄糖、孜然粉、黑胡椒粉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、天然豬腸衣。

發(fā)酵劑：木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)X21-2m及植物乳桿菌(Lactobacillesplantarum)X19-2D均為內蒙古農(nóng)業(yè)大學肉品實驗室保藏。漢森發(fā)酵劑：木糖葡萄球菌和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

試劑：異丙醇、乙醚,天津市富宇精細化工公司；冰乙酸,天津市永晟精細化工公司；氯仿、甲醇,國藥集團化學試劑公司；正己烷(色譜純),天津市光復精細化工研究所；所有分離用有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HN200氮吹儀，海能儀器；AM204電子天平，梅特勒-托利多儀器公司；FSH-2可調高速勻漿機，常州國華電器公司；通風櫥、SC-3612低速離心機、Clarns680氣相色譜儀、JC-HW-2旋渦振蕩器，濟南精誠試驗儀器公司；TCP全自動測色色差計，北京奧依克光電儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵香腸的制備

1.3.1.1 工藝配方

精選羊后腿肉(占量80%)，去筋；羊尾肥膘(占量20%)。輔料主要為葡萄糖0.5%、食鹽2.5%、蔗糖0.5%、孜然粉0.5%、黑胡椒粉0.5%、亞硝酸鈉70 mg/kg、硝酸鈉100 mg/kg。

1.3.1.2 發(fā)酵香腸的制備

輔料、發(fā)酵劑

↓

原料肉→瘦肉絞碎、肥肉切丁→攪拌制餡→低溫腌制(4 ℃，12 h)→灌腸→發(fā)酵(24 ～25 ℃，RH 98%～95%，3 d)→干燥成熟(14～15 ℃，RH 90%～65%，11d)→真空包裝→成品

分組：自然組(未添加發(fā)酵劑)；漢森組(添加科·漢森發(fā)酵劑，0.125 g/kg)；復配組(添加木糖葡萄球菌X21-2m與植物乳桿菌X19-2D 2∶1的混合菌株，107CFU/g)。

1.3.1.3 樣品的采集

分別于香腸加工過程中發(fā)酵結束(3 d)、加工結束(11 d)、貯藏(4 ℃真空)1周(18 d)、2周(25 d)、貯藏第1個月(41 d)、2個月(71 d)、5個月(161 d)各時間點隨機抽取樣品，用于香腸各指標的測定。

1.3.2 脂肪氧化指標的測定

1.3.2.1 酸價(acid value，AV)的測定

參照GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》進行測定[14]。

1.3.2.2 過氧化值(peroxide value，POV)的測定

參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》進行測定[15]。

1.3.2.3 硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的測定

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》進行測定[16]。

1.3.3 游離脂肪酸的測定

1.3.3.1 脂肪的提取

參照FOLCH等[17]的方法提取脂質，取發(fā)酵香腸1.0 g，加入氯仿-甲醇(2∶1，V∶V)20 mL后低速勻漿，靜置1 h，過濾后加入0.2倍體積的生理鹽水(7.3 g/L NaCl，0.5 g/L CaCl2)，3 600 r/min離心15 min，吸凈上層液體，剩余液體用氮吹儀吹干溶劑。

1.3.3.2 脂肪酸的甲酯化

稱取揮干溶劑后的脂質0.15 g，加入2 mL 14%三氯化硼-甲醇進行甲酯化(60 ℃水浴30 min)，冷卻后加入2 mL水和2 mL正己烷振蕩混勻，靜置分層后吸取上層液體，揮干溶劑，加入100 μg/mL十七酸甲酯做內標，用正己烷定容，以備氣相測定。

1.3.3.3 氣相條件

色譜柱：SP2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；檢測器溫度：260 ℃；升溫程序：120 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至230 ℃，保持3min，以1.5 ℃/min升至240 ℃，保持13 min；氣體流速：H245.0 mL/min，空氣450.0 mL/min，氮氣1.0 mL/min，進樣量1.0 μL；分流比1∶10。

1.3.3.4 定性定量分析

根據(jù)37 種脂肪酸甲酯混標來確定各脂肪酸的保留時間進行定性分析；以十七酸甲酯為內標物質進行定量分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3次，結果表示為平均數(shù)±SD，圖表采用Excel進行繪制，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS Statistics 18 統(tǒng)計分析軟件中的比較均值中的獨立樣品T檢驗進行顯著性分析，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 酸價(AV)

AV表示脂肪中游離脂肪酸含量，可作為衡量脂肪分解程度的指標[18]。圖1所示，AV總體呈現(xiàn)上升趨勢，表明發(fā)酵香腸的脂肪不斷分解為脂肪酸，且脂肪酸的生成速度大于分解速度，與許美娜等的研究成果一致[19]。

圖1 各組發(fā)酵香腸AV隨加工貯藏時間的變化Fig.1 Changes of AV of fermented sausages in each group with processing and storage time

發(fā)酵香腸在3～18 d，自然組、漢森組、復配組AV分別提高了1.95、2.92和4.03 mg/g，復配組提高最多。在18、41、71d，復配組和漢森組AV顯著高于(P<0.05)自然組。由此可以證明，復配發(fā)酵劑有利于發(fā)酵香腸脂肪的分解。

2.2 過氧化值(POV)

POV表示脂質氧化初級產(chǎn)物過氧化物的積累量[20]。由圖2可知，各發(fā)酵組POV均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，各發(fā)酵組變化顯著(P<0.05)，與李鈺[21]、SOHN等[22]實驗結果一致，可能因為過氧化物不穩(wěn)定可繼續(xù)氧化分解為其他物質。在11～18 d，復配組的POV增長率為156%，高于其他2組。在41d，復配組POV顯著高于(P<0.05)其他2組。在71 d，各組香腸的POV達到最大值，自然組、漢森組、復配組分別為2.54 mmol/kg、2.96 mmol/kg和3.31 mmol/kg，復配組最高，但差異不顯著(P>0.05)。說明復配發(fā)酵劑的添加，對脂肪氧化初級產(chǎn)物的產(chǎn)生有一定的作用。

圖2 各組發(fā)酵香腸POV隨加工貯藏時間的變化Fig.2 Changes of POV of fermented sausages in each group with processing and storage time

2.3 硫代巴比妥酸值(TBARS)

TBARS值表示組織中丙二醛的累積量。丙二醛是由不飽和脂肪酸分解所產(chǎn)生的[23]，代表著脂質二級氧化產(chǎn)物。由圖3可知，各發(fā)酵組的TBARS值先顯著上升(P<0.05)后下降，可能因為貯藏前期不飽和脂肪酸分解較快，醛類物質積累，貯藏后期醛類與肉中的蛋白質、氨基酸或其他含有氨基側鏈基團的物質發(fā)生羰氨反應[24]。在3～11 d，TBARS持續(xù)増加，說明脂肪酸在低溫條件下也可以發(fā)生氧化[25]。在41 d，復配組TBARS達到最大值0.35 mg/kg。在41～161 d，漢森組和復配組的TBARS顯著高于(P<0.05)自然組，繼而證明復配發(fā)酵劑可提高發(fā)酵香腸脂肪氧化能力。

圖3 各組發(fā)酵香腸TBARS隨發(fā)酵香腸加工貯藏時間的變化Fig.3 Changes of TBARS of fermented sausages in each group with processing and storage time

2.4 游離脂肪酸的變化

脂質在脂肪酶和磷脂酶的作用下被分解為甘油酯和磷脂釋放游離脂肪酸，釋放的游離脂肪酸直接影響發(fā)酵香腸的風味[26]。由表1可知，共檢測出15種脂肪酸，主要脂肪酸是C16∶0、C18∶0和C18∶1n9c，與王柏輝[27]、CHEN等[28]研究一致。

表1 各組發(fā)酵香腸游離脂肪酸隨加工貯藏時間的變化 單位：mg/g(脂肪)

續(xù)表1

結構簡式分組3 d11 d18 d25 d41 d71 d161 d自然組0.1650.3180.3550.3070.3090.2760.298C17∶1漢森組0.2650.2800.2890.3020.3070.3300.292復配組0.1450.2960.2560.3410.4470.3180.225自然組3.3404.3095.1826.2035.7505.4705.434C18∶0漢森組3.7805.3345.2825.1456.0156.3245.453復配組2.8776.3795.2865.6867.0105.7964.045自然組0.4280.7261.2280.8420.7610.7261.066C18∶1n9t漢森組0.4571.0350.9041.1540.8780.8160.827復配組0.3541.3350.7321.4071.6271.1370.650自然組7.42312.67315.11215.30713.61715.26412.846C18∶1n9c漢森組9.28513.07812.64414.18413.71718.08517.079復配組6.35515.97410.85415.47121.36316.32613.702自然組-0.1040.1490.1500.1360.1160.129C18∶2n6t漢森組0.0670.1360.1460.1470.0880.1300.123復配組-0.1590.1050.1080.1970.138-自然組0.6241.4021.2061.2401.7371.3510.886C18∶2n6c漢森組1.2251.0431.2341.2291.4131.3421.121復配組0.6241.4021.2061.2291.7371.3510.886自然組0.2860.3870.5250.5780.6700.5350.558C18∶3n3漢森組0.3830.4530.6130.5560.6930.6310.524復配組0.2770.5030.4460.6250.8370.5960.510自然組0.0740.1270.1820.1910.1770.1620.175C21∶0漢森組0.0830.1600.2100.1900.1930.1990.179復配組0.0620.2140.1370.2460.2990.1870.138自然組-0.0460.0510.0550.080-0.054C22∶0漢森組0.056-0.0470.0490.058--復配組-0.0490.0460.0570.1000.058-

注：-為未檢測出。

各組香腸中的C16∶0、C18∶0和C18∶1n9c，呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，與黃金枝等[29]實驗結果相同，后期下降可能是因為水分逐漸降低，酶活力減弱，脂肪分解能力下降。在3～11 d，各脂肪酸的生成量明顯增加，且復配組增長最快。在11、25、41 d，復配組的C16∶0含量明顯高于其他2組。在11、18、41 d，復配組的C18∶0含量明顯高于其他2組。C18∶1n9c是發(fā)酵香腸中含量最高的脂肪酸，是重要的風味前體物質[20]。在41 d，復配組的C18∶1n9c含量達到最大值21.363 mg/g，明顯高于其他兩組?？梢钥闯?，復配發(fā)酵劑的使用有利于游離脂肪酸的產(chǎn)生，對發(fā)酵香腸風味的改善有促進作用。

2.5 飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的變化

脂肪酸一般可分為SFA、MUFA、PUFA三類。SFA主要為人體提供能量，可增加人體膽固醇和中性脂肪。不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)是人體不能合成必須從膳食中獲取的脂肪酸，有調節(jié)血脂、清理血栓、提高人體的免疫力等功能，對人體有重要的意義[30]。

由表1可知，共檢測出7種飽和脂肪酸，其中C16∶0，C18∶0的含量相對較高，其余SFA含量在1 mg/g以下。各組SFA在加工及貯藏時間均呈先增長后下降趨勢。在3～11 d，各組香腸的SFA含量增長較大，自然組、漢森組和復配組分別增長了3.67 mg/g、3.005 mg/g和13.142 mg/g，其中復配組增長幅度最大，可能是添加具有脂肪分解作用的木糖葡萄球菌加速了脂肪酸的產(chǎn)生。在貯藏后期，各組SFA逐漸下降，在161 d，復配組SFA含量為11.25 mg/g，明顯低于其他2組。

由表1可示，共檢測出5種單不飽和脂肪酸，其中C18∶1n9c的含量相對較高，在41 d，復配組的C18∶1n9c的含量達到最大值21.363 mg/g。由表2可知，在3～11 d，各組香腸的MUFA含量驟增，這可能是PUFA轉化為MUFA的速率大于MUFA轉化為SFA的速率[31]，且復配組最為明顯，增長了11.451 mg/g。在11、18、41d，復配組的MUFA明顯高于其他2組。在41 d以后，MUFA處于下降趨勢，可能是因為其氧化速度大于產(chǎn)生速度?？梢哉f明，在貯藏初期，復配組的MUFA相對較高。

表2 各組發(fā)酵香腸SFA、MUFA、PUFA隨加工貯藏時間的變化 單位：mg/g(脂肪)

由表1所示，共檢測出3種PUFA，分別為C18∶2n6t，C18∶2n6c和C18∶3n3，其中C18∶3n3是人體必需脂肪酸，是維持生命的重要物質，能在體內經(jīng)脫氫和碳鏈延長合成C20∶5、C22∶6等代謝產(chǎn)物[31]，C20∶5、C22∶6對腦功能、智力和視力發(fā)育有重要意義，在41 d，復配組的C18∶3n3含量明顯大于其他2組。PUFA最易被氧化[32-33]，所以含量明顯少于SFA和MUFA。各組PUFA的均呈先上升后下降趨勢，在3～11 d，各組PUFA增長較快。復配組在41d達到最大值2.771 mg/g，高于其他2組，隨后不斷下降，說明貯藏時間越長，轉化為其他物質的PUFA越多。

2.6 脂肪酸比例的變化

隨著對脂肪營養(yǎng)的深入研究,脂肪酸的營養(yǎng)及預防疾病的作用、攝入量等日益受到關注。n-6 PUFA/n-3 PUFA是一個評價肉制品品質的重要標準，經(jīng)研究表明，過高的n-6 PUFA和n-6 PUFA/n-3 PUFA可促進多種疾病的爆發(fā)，如心血管疾病、癌癥和炎癥和自身免疫性疾病。n-6 PUFA/n-3 PUFA的值應控制在4以下為宜[34]。

表3 各組發(fā)酵香腸n-6PUFA/n-3PUFA隨加工貯藏時間的變化Table 3 Changes of n-6PUFA/n-3PUFA of fermentedsausage in each group with processing and storage time

由表3可知，各組發(fā)酵香腸各個時間段的n-6PUFA/n-3PUFA值皆在4.0以下，只是自然組在11 d時接近4。在25～161 d，復配組的n-6PUFA/n-3PUFA的值略低于自然組。

PUFA/SFA是評價肉制品營養(yǎng)質量的重要指標之一，減少SFA的含量，增加PUFA的含量更有利于人的身體健康[35]。由表4所示，復配組和漢森組PUFA/SFA的變化趨勢一致，自然組變化波動較大。在18～161 d，漢森組和復配組PUFA/SFA的比值變化不明顯，相比于自然組更穩(wěn)定。

表4 各組發(fā)酵香腸PUFA/SFA隨加工及貯藏時間的變化Table 4 Changes of PUFA/SFA of fermented sausage ineach group with processing and storage time

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，在18、41、71 d，復配組和漢森組的AV顯著高于(P<0.05)自然組；復配組的POV高于其他2組，但差異不顯著(P>0.05)；在41～161 d，復配發(fā)酵組和漢森發(fā)酵組的TBARS顯著高于(P<0.05)自然組；在11和41 d，復配組主要脂肪酸C16:0、C18:0和C18:1n9c含量皆高于其他2組,在18～161 d，n-6PUFA/n-3PUFA值略低于自然組，PUFA/SFA的值相對穩(wěn)定。研究證明，復配發(fā)酵劑的使用加速了香腸的脂肪氧化程度，并未出現(xiàn)不良現(xiàn)象，各指標都在安全范圍之內，對改善發(fā)酵肉制品風味有重要意義，其脂肪酸比例更有益于人體健康。