姚文婷，陳蘭明*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

國(guó)內(nèi)外大量研究表明，乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)具有調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)平衡、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫功能及延緩衰老等生理功能[1]。耐久腸球菌(Enterococcusdurans)隸屬于硬桿菌門(Firmicutes)，桿菌綱(Bacilli)，乳酸桿菌目(Lactobacillales)，腸球菌科(Enterococcaceae)，腸球菌屬(Enterococcus)。該菌是動(dòng)物腸道微生物的重要組分，且常見于發(fā)酵食品，如酸奶和奶酪中[2]。不同來源的耐久腸球菌的生物學(xué)特性和生理功能各不相同[3-4]。例如，黃堅(jiān)等[5]從牦牛發(fā)酵酸奶中篩選到耐久腸球菌SWUN5857菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠適應(yīng)小鼠胃腸環(huán)境，有效提高小鼠體質(zhì)量，促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟發(fā)育，增強(qiáng)小鼠免疫功能。LIU等[6]從內(nèi)蒙古天然發(fā)酵奶油中分離到耐久腸球菌KLDS6.0930菌株，該菌則具有耐膽鹽，吸收膽固醇等作用。

耐低溫LAB不僅能夠有效抑制腐敗菌在低溫下的生長(zhǎng)和繁殖，而且，在食品發(fā)酵過程中因其低溫適應(yīng)性，有助于降低生產(chǎn)能耗，節(jié)約企業(yè)成本。因此，耐低溫LAB的篩選對(duì)于食品加工與貯藏具有重要意義。然而，大多數(shù)LAB屬于中溫型微生物，一般最適生長(zhǎng)溫度為30～40 ℃；在低于10 ℃的溫度下，LAB生長(zhǎng)微弱，甚至不生長(zhǎng)[7]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)嗜冷LAB的研究已有報(bào)道。例如，LI等[8]報(bào)道了3株在15 ℃生長(zhǎng)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) LZ95、CY2和CY3菌株，其中，LZ95菌株在de Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，OD620nm值增加了10倍。LI等[9]從藏牦牛瘤胃中分離到具有纖維素分解能力的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) JF85和Y83菌株，發(fā)現(xiàn)它們能夠在15 ～55 ℃的溫度下生長(zhǎng)。

本研究基于前期研究基礎(chǔ)，聚焦于1株分離自中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品且具有良好的體外抗氧化性的耐久腸球菌C11菌株(E.duransC11)[10]，分析該菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的耐受性，并運(yùn)用比較基因組學(xué)方法探討E.durans的低溫適應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

耐久腸球菌C11菌株分離自我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品——乳餅[10]，由本實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基、主要試劑及儀器

MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS) (pH 7.4)、λ/HindIII DNA Marker (MD202)、6×Loading buffer，天根生化科技有限公司；Takara MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；膽鹽和瓊脂，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶(活性1∶3 000)、胰酶(活性1∶250)、微孔過濾膜(0.22 μm)、NaCl，上海生工生物工程有限公司；多功能酶標(biāo)儀，BioTek公司；雷磁pHS-3C pH儀，上海雷磁儀器廠；Research?plus pipette移液器、臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)5417R、高速冷凍離心機(jī)5424、PCR儀，Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)Molecular Imager?Gel DocTMXR+ System，Bio-Rad公司；全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，Bioscreen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1E.duransC11菌株的培養(yǎng)

參考XU等[10]的方法，E.duransC11菌株以體積分?jǐn)?shù)1%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，連續(xù)傳代培養(yǎng)2代，得到新鮮培養(yǎng)物。4 000 r/min離心10 min，用無菌PBS洗滌菌體3次(避免帶入接種物中的酸性物質(zhì)從而改變pH)。用適量的PBS懸浮菌體沉淀作為種子液備用。

1.2.2 溫度、酸、滲透壓的耐受性分析

按照1%體積分?jǐn)?shù)的接種量將新鮮種子液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在不同溫度(10、15、20、25、37、45 ℃)培養(yǎng)72 h，采用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀實(shí)時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD600 nm)，3次重復(fù)。

按照1%體積分?jǐn)?shù)的接種量將新鮮種子液分別接種到不同起始pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、5.0%、8.0%、10.0%、12.0%、15.0%)、以及不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%)的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，實(shí)時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)物的OD600 nm值，3次重復(fù)。

1.2.3 人工胃液及腸液的耐受性分析

參照ZHANG等[11]的方法制備人工模擬胃液(pH 2.0)和人工模擬腸液(pH 6.8)。按照10%體積分?jǐn)?shù)將新鮮種子液分別接種于經(jīng)膜過濾除菌的1.0 mL人工胃液和人工腸液中，充分混勻，分別于37 ℃孵育180 min和240 min后取樣，10倍梯度稀釋，以標(biāo)準(zhǔn)平板法計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌的存活率，實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA的制備

采用Takara MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書步驟提取E.duransC11菌株的基因組DNA。采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定DNA樣品的濃度和純度(A260/A280)。

1.2.5 基因組DNA序列的測(cè)定、質(zhì)控和裝配

運(yùn)用Illumina HiSeq Xten測(cè)序平臺(tái)，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司測(cè)定E.duransC11全基因組序列。采用FASTQC軟件[12]分析原始序列reads的質(zhì)量。采用SOAP denovo軟件(version 2.04)(http://soap.genomics.org.cn/)進(jìn)行序列裝配。

1.2.6 基因組注釋

采用Glimmer (Version 3.0)[13]、tRNA_scan-SE (Version 1.3.1)[14]、RNAmmer (Version 1.2)軟件[15]分別預(yù)測(cè)編碼基因、tRNA、rRNA基因。采用Prophage Finder預(yù)測(cè)噬菌體序列(http://phast.wishartlab.com/)。采用CRISPRFinder軟件[16]預(yù)測(cè)CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)位點(diǎn)。采用PGAP[17]、CD-Search[18]、SignalP 4.1 Serve[19]、TMHMM[20]軟件分別預(yù)測(cè)假基因、Pfam域的基因、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域。通過比對(duì)毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB(virulence factors database) (http://www.mgc.ac.cn/VFs/)、耐藥基因數(shù)據(jù)庫ARDB (antibiotic resistance genes database) (http://arpcard.mcmaster.ca) 分別預(yù)測(cè)毒力、耐藥基因(Identity>70%, E<1e-10)。

1.2.7 比較基因組分析

截止到2018年12月20日，從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)中檢索到17株E.durans菌株的基因組序列，其中3株菌為全基因組序列，14株菌為基因組草圖，及E.duransC11共18株耐久腸球菌用于比較基因組分析(表1)。采用BLAST(basic local alignment search tool)軟件比對(duì)分析菌株特異基因(閾值e-10)。采用CD-HIT[21]、Muscle軟件[22]分析同源基因并對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)。采用PhyML軟件[23]以鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并且進(jìn)行1 000次bootstrap校驗(yàn)，使用Evolview軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度對(duì)E. durans C11菌株生長(zhǎng)的影響

本研究測(cè)定了E.duransC11菌株在不同溫度下(10～45 ℃)的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1所示。在45 ℃高溫條件下，E.duransC11在MRS培養(yǎng)基(pH 6.8)中幾乎不能生長(zhǎng)；與最適生長(zhǎng)溫度(37 ℃)相比，在25 ℃條件下，E.duransC11仍生長(zhǎng)較快，約6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，21 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，30 h到達(dá)穩(wěn)定期；在20 ℃和15 ℃條件下，該菌株約6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，27 h到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，42 h到達(dá)穩(wěn)定期；在10 ℃條件下，菌株生長(zhǎng)緩慢，約12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，40 h到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，54 h到達(dá)穩(wěn)定期。上述結(jié)果表明，E.duransC11菌株在MRS培養(yǎng)基中能夠適應(yīng)10～25 ℃的低溫條件。

注：“-”未知。

圖1 溫度對(duì)耐久腸球菌C11菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of temperatures on the growth ofE. durans C11

2.2 不同起始pH值對(duì)E. durans C11菌株生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，當(dāng)MRS培養(yǎng)基的pH為2.0～4.0時(shí)，E.duransC11菌株生長(zhǎng)緩慢甚至不生長(zhǎng)，其OD600nm值無明顯改變。當(dāng)pH為5.0～6.0時(shí)，E.duransC11菌株能夠生長(zhǎng)，但與最適生長(zhǎng)pH (6.8～7.0)相比，酸性培養(yǎng)條件(pH 5.0～6.0)顯著抑制了E.duransC11的生長(zhǎng)。

圖2 不同起始pH值對(duì)耐久腸球菌C11生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effect of different initial pH on the growth ofE. durans C11

2.3 E. durans C11菌株對(duì)NaCl的耐受性

與沒有添加NaCl的MRS培養(yǎng)基相比，添加5.0%的NaCl顯著抑制了E.duransC11菌株的生長(zhǎng)，約6 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16 h到達(dá)對(duì)數(shù)中期，24 h到達(dá)穩(wěn)定期；當(dāng)MRS培養(yǎng)基中添加的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8.0%時(shí)(8.0%～15.0%)，E.duransC11菌株幾乎不能生長(zhǎng)(圖3)。

圖3 耐久腸球菌C11對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的耐受性Fig.3 Tolerance of E. durans C11 to different concentrations of NaCl

2.4 E. durans C11菌株對(duì)膽鹽的耐受性

如圖4所示，當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.05%時(shí)，E.duransC11菌株不能生長(zhǎng)，表明該菌株對(duì)膽鹽(0.05%～0.3%)無耐受性。

圖4 耐久腸球菌C11對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽的耐受性Fig.4 Tolerance of E. durans C11 to different concentrations of bile salt

2.5 E. durans C11菌株對(duì)人工胃腸液的耐受性

E.duransC11菌株對(duì)人工胃液(pH 2.0)、人工腸液(pH 6.8)的耐受性如表2所示。在人工胃液中處理180 min后，E.duransC11菌株的存活率為52.5%；而在人工腸液中處理240 min后，E.duransC11的存活率為85.1%，表明E.duransC11菌株對(duì)人工腸液的耐受性較強(qiáng)。

表2 耐久腸球菌C11對(duì)人工胃液及腸液的耐受性Table 2 Tolerance of E. durans C11 to artificialgastric and intestinal fluids

2.6 E. durans C11基因組草圖特征

運(yùn)用Illumina Hiseq二代測(cè)序技術(shù)，本研究測(cè)定獲得了E.duransC11的全基因組草圖，共獲得3 126 666條reads，序列全長(zhǎng)為2 988 204 bp，GC含量為37.68%。序列裝配得到111個(gè)Scaffolds，測(cè)序深度為151×。通過基因組序列分析，預(yù)測(cè)到2 986 個(gè)基因，包括2 715個(gè)蛋白編碼基因，77個(gè)RNA基因，194個(gè)假基因。E.duransC11基因組中比對(duì)到Pfam域、信號(hào)肽、跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的基因分別有2 278、137、713個(gè)。另外，鑒定到3個(gè)CRISPR重復(fù)序列，其中包含1個(gè)未知的CRISPR序列，位于scaffold 18的16 679～16 757 bp之間，長(zhǎng)度為24 bp；2個(gè)已知的CRISPR序列，分別位于scaffold 30 的 3 942～4 175 bp和scaffold 53的16 419 ～16 618 bp之間，長(zhǎng)度分別為24、36 bp，分別編碼假設(shè)蛋白和復(fù)制蛋白(replication protein, RepA)。還鑒定到1個(gè)完整的原噬菌體基因簇，位于scaffold 3的580～16 832 bp之間，序列全長(zhǎng)為16.2 kb，共編碼25個(gè)蛋白，其中20個(gè)編碼原噬菌體相關(guān)蛋白，5個(gè)編碼假設(shè)蛋白(表3)。

表3 E. durans C11基因組測(cè)序數(shù)據(jù)Table 3 E. durans C11 genome statistics

注：“-”:未知

E.duransC11基因組中還鑒定到2個(gè)耐藥基因(tetm、baca)，分別與四環(huán)素(tetracycline)、桿菌肽(bacitracin)抗性相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)了17個(gè)編碼黏附素、產(chǎn)胞外酶、膜表面蛋白、莢膜多糖等相關(guān)基因(efaA、eno、gapA、tuf、bsh、GroEL、bopD、srt2/srt1/bee1/bee3、pilF、pilB、hasC)，可能與耐久腸球菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、定殖、侵染等相關(guān)[27]。

2.7 比較基因組分析

2.7.1E.duransC11基因組預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)編碼基因的COG功能分類

比較基因組分析揭示了18株E.durans菌株的基因組中48 112個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，它們?cè)贑11菌株基因組中的COG功能分類如表4所示。

表4 E. durans C11基因組預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)編碼基因的COG功能分類Table 4 The number of genes classified into the 24 COGfunctional categories in E. durans C11 genome

續(xù)表4

分類E. durans C11基因個(gè)數(shù)占比/%功能描述F752.76核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝S54920.22未知功能P1224.49無機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝U230.85細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌、小泡運(yùn)輸I481.77脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝R00.00胞外結(jié)構(gòu)O622.28翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白L2489.13復(fù)制、重組和修復(fù)A10.04RNA加工和修飾B00.00染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)Q210.77次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解代謝T612.25信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制K1846.78轉(zhuǎn)錄J1545.67翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成Y00.00核結(jié)構(gòu)-1 21017.61未匹配到數(shù)據(jù)庫

E.duransC11基因組中約2 237個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因比對(duì)到COG數(shù)據(jù)庫，分屬24個(gè)功能分類(表4)。其中，編碼未知功能(S)，復(fù)制、重組和修復(fù)(L)，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(G)，轉(zhuǎn)錄(K)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成(J)基因的占比位居前5位，分別占所有蛋白編碼基因的20.22%、9.13%、7.40%、6.78%、5.67%。

2.7.2E.durans基因組系統(tǒng)發(fā)育樹

基于18株E.durans基因組的同源基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。由圖5可見，18株E.durans的基因組聚為3簇，分別為cluster α、 β、γ。其中，cluster γ又聚為2個(gè)亞類，分別為Subcluster I和Subcluster II。在Subcluster II中，E.duransC11與E.duransNCTC8130、E.durans18S菌株具有相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中，E.durans18S分離自奶酪，而E.duransNCTC8130的來源未知，它們的生物學(xué)特性均未有報(bào)道。

圖5 18株耐久腸球菌基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 A phylogenetic tree of the 18 E. durans genomes

2.7.3E.duransC11菌株的特異基因

比較基因組分析揭示了E.duransC11基因組中33個(gè)菌株特異基因，其中，26個(gè)編碼假設(shè)蛋白，7個(gè)分別編碼螺旋轉(zhuǎn)角螺旋域蛋白(helix-turn-helix domain-containing protein) (EIA52_00535)、環(huán)內(nèi)酯自誘導(dǎo)肽(cyclic lactone autoinducer peptide) (EIA52_00555)、I型限制性內(nèi)切酶R亞基(type I restriction endonuclease subunit R) (EIA52_06120)、DUF3037域結(jié)合蛋白(DUF3037 domain-containing protein) (EIA52_12720)、切除酶(excisionase) (EIA52_13810)、CPBP家族膜內(nèi)金屬蛋白酶(CPBP family intramembrane metalloprotease) (EIA52_13980, EIA52_13990)，它們與E.duransC11的低溫適應(yīng)性關(guān)系機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

2.8 E. durans C11可能的低溫適應(yīng)機(jī)制

2.8.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂組成

當(dāng)環(huán)境溫度下降時(shí)細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，細(xì)胞難以發(fā)揮正常生理功能。然而，耐低溫菌通過改變膜脂組成，如提高不飽和脂肪酸比例來調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性[28]。在大腸桿菌(Escherichiacoli)中，參與不飽和脂肪酸合成的2個(gè)關(guān)鍵酶為3-羥基癸脂酰ACP脫水異構(gòu)酶(3-hydroxydecanoyl-ACP dehydratase/isomerase, FabA)和3-酮脂酰ACP合成酶 I(3-Ketoacyl-ACP synthase I, FabB)[29]。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性菌糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)基因組中含有fabZ1 (EIA52_09905)和fabF1 (EIA52_10800)基因，分別與大腸桿菌fabA和fabB序列高度同源[30]。在本研究中，從E.duransC11基因組中鑒定到fabZ1和fabF1基因，它們與E.faecalis中的fabZ1和fabF1有較高的氨基酸序列同源性(97%, 91%)，推測(cè)E.duransC11可能通過FabZ1-FabF1途徑合成不飽和脂肪酸，以增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，減少低溫對(duì)細(xì)胞的損傷。

2.8.2 增加細(xì)胞內(nèi)相容性溶質(zhì)(compatible solutes)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，相容性溶質(zhì)(如甘氨酸、甜菜堿、甘油、海藻糖、甘露醇和山梨醇等)能夠在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累到很高濃度，并保護(hù)細(xì)胞免受低溫、高溫、干燥等應(yīng)激損害[31]。在本研究中，通過比較基因組分析，在E.duransC11基因組中鑒定到編碼甘氨酸/甜菜堿/膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)(glycine betaine/carnitine transport)的基因簇(OpuABCD) (EIA52_01405, EIA52_12825, EIA52_12830, EIA52_12835, EIA52_12840)。研究發(fā)現(xiàn)，在15 ℃培養(yǎng)條件下，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)利用甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OpuA、OpuC和OpuD將甜菜堿攝入細(xì)胞，或利用前體膽堿合成甜菜堿，從而保護(hù)細(xì)胞免受低溫?fù)p傷[32]。

2.8.3 改變蛋白質(zhì)的氨基酸組成

KREIL等[33]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度降低時(shí)，蛋白質(zhì)中谷氨酰胺(Gln)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、組氨酸(His)的含量增加。另外，嗜冷酶通過疏水性脯氨酸(Pro)含量的減少來提高酶的柔韌性[34]，使酶的活性中心更容易與底物接近，使之在低耗能時(shí)發(fā)揮作用。本研究中E.duransC11在低溫條件下表達(dá)蛋白質(zhì)中Gln、Ser、Thr、His和Pro的含量變化情況有待蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究。

2.8.4 冷激蛋白和熱激蛋白

冷激蛋白(cold shock proteins, Csps)參與細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊，以及細(xì)胞膜流動(dòng)性的調(diào)控等[35]。熱激蛋白(heat shock proteins, Hsps)不僅在細(xì)菌的熱應(yīng)激,而且在冷應(yīng)激中也發(fā)揮作用,原因在于許多Hsps是分子伴侶，在低溫及其他應(yīng)激條件下同樣被誘導(dǎo)表達(dá)[36]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度發(fā)生變化時(shí)，分子伴侶可以在原位調(diào)控蛋白質(zhì)暴露的活性區(qū)域之間的相互作用，使蛋白折疊成為正確的構(gòu)象[37]。在本研究中，比較基因組分析揭示了E.duransC11基因組4個(gè)分子伴侶：GrpE (EIA52_03480)、DnaJ (EIA52_03490)、DnaK (EIA52_03485)、hslO (EIA52_12115)；2個(gè)Hsps (EIA52_03735, EIA52_12085)；1個(gè)Hsps轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子hrcA (EIA52_03475)；6個(gè)Csps (EIA52_03155, EIA52_04230, EIA52_04370, EIA52_09445, EIA52_13120, EIA52_11270)。此外，在E.duransC11基因組中還鑒定到1個(gè)DEAD-box ATP-dependent RNA解旋酶編碼基因(CshB，EIA52_09480)，與DEAD-box RNA解旋酶CsdA(Psyc_1082)氨基酸序列同源性為32%。當(dāng)溫度下降時(shí)，CsdA促進(jìn)mRNA的解旋，調(diào)控微生物基因表達(dá)[38]。

2.8.5 應(yīng)激相關(guān)調(diào)節(jié)子

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下，副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus) CHN25的應(yīng)激相關(guān)調(diào)節(jié)子編碼基因表達(dá)上調(diào)，例如LysR、GntR、MerR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、3’-5’-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)受體蛋白(CRP)。在本研究中，在E.duransC11基因組中鑒定到CRP(EIA52_03380, EIA52_06660, EIA52_08790, EIA52_13485)、LYSR(EIA52_00465, EIA52_09350, EIA52_09710, EIA52_12995)、GntR(EIA52_00775, EIA52_00995, EIA52_03005, EIA52_04360, EIA52_05535, EIA52_11320)、MerR(EIA52_02670, EIA52_03215, EIA52_03870) 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子等編碼基因[39]。CRP是一種參與糖代謝的調(diào)節(jié)因子，在大腸桿菌的冷適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。據(jù)研究報(bào)道，細(xì)菌對(duì)于零下溫度的適應(yīng)涵蓋了能量的合成、翻譯、運(yùn)輸?shù)确矫鎇40]。例如，低溫嗜冷桿菌(Psychrobactercryohalolentis) K5菌株能夠在-4 ℃下誘導(dǎo)一些重要調(diào)控子的表達(dá)，如調(diào)節(jié)能量需求的F1/F0 ATP合成酶，在低溫下排除有害物質(zhì)的外膜外排系統(tǒng)蛋白(TolC)，加快翻譯過程的延伸因子Ts(EF-Ts)等，這些基因在E.duransC11基因組中均被鑒定到(EIA52_00860, EIA52_06915, EIA52_06625)，可能與其低溫適應(yīng)性相關(guān)。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)耐久腸球菌C11菌株能夠在15～25 ℃溫度條件下生長(zhǎng)。該菌株的基因組草圖已被測(cè)定，全長(zhǎng)2 988 204 bp，GC含量37.68%，GenBank序列登錄號(hào)為RQWF00000000。比較基因組學(xué)分析揭示了E.duransC11的33個(gè)菌株特異性基因，以及大量參與細(xì)胞膜脂組成、相容性溶質(zhì)吸收或合成、環(huán)境脅迫應(yīng)激調(diào)控等相關(guān)基因，可能與其低溫適應(yīng)相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步分析將有助于闡釋耐久腸球菌低溫適應(yīng)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。