程滿環(huán),鄭雪怡，朱媛媛，張 娜

黃山學(xué)院現(xiàn)代教育技術(shù)中心；2黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，黃山 245041

絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino為葫蘆科絞股藍(lán)屬(GynostemmaBl.)多年生草質(zhì)藤本植物，主要散布在中國(guó)的湖南，湖北，云南，廣西等省，被譽(yù)為“南方人參”、“不老長(zhǎng)壽藥草”[1]。其藥用價(jià)值很高，現(xiàn)代研究表明，絞股藍(lán)具有降三高、抗衰老、提高免疫力、抗腫瘤等功能[2-6]。絞股藍(lán)中含有豐富的皂苷類、黃酮類、多種氨基酸和微量元素等，其中，皂苷類物質(zhì)是絞股藍(lán)主要活性物質(zhì)，一直是研究的熱點(diǎn)，文獻(xiàn)報(bào)道已有一百多種皂苷類物質(zhì)從絞股藍(lán)中分離鑒定出來(lái)，絞股藍(lán)皂苷與人參皂苷結(jié)構(gòu)相似，主要為達(dá)瑪烷型結(jié)構(gòu)[7-9]。

目前，絞股藍(lán)皂苷提取、分離、鑒定的主要方法是“通法”提取、分離得到純品后進(jìn)行表征[10-13]。整個(gè)流程存在工作量大，耗時(shí)、消耗大量溶劑等不足。超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)能快速實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分的分離鑒定，已成為中藥化學(xué)研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域[14-18]。

黃山野生絞股藍(lán)資源非常豐富，但基本處于未開(kāi)發(fā)利用狀態(tài)。本項(xiàng)目擬選取黃山野生絞股藍(lán)為研究對(duì)象，采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，以具有代表性的達(dá)瑪烷型皂苷標(biāo)準(zhǔn)品裂解規(guī)律和特征碎片離子為診斷信息，結(jié)合Masslynx軟件、ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)以及文獻(xiàn)資料，分離鑒定黃山野生絞股藍(lán)中皂苷類物質(zhì)，為黃山野生絞股藍(lán)的開(kāi)發(fā)、利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)waters公司，型號(hào)：UPLC H-CLASS+QTOF G2-XS)，配有電噴霧離子源(ESI)，MassLynx V4.1軟件。

1.2 試藥

絞股藍(lán)樣品采自于黃山學(xué)院校園內(nèi)，經(jīng)黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院翟大才副教授鑒定確認(rèn)，憑證標(biāo)本(標(biāo)本號(hào)：HS20170828)存放于黃山學(xué)院分析測(cè)試中心。人參皂苷Rb1、Rb3、Re、Rd對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號(hào)分別為110704-201223、111686-201504、110754-201324和111818-201603；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；純水為Milli-Q系統(tǒng)純化水(美國(guó)Millipore公司)；其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

新鮮絞股藍(lán)樣品，50 ℃下烘干，粉碎，過(guò)3號(hào)藥篩備用。稱取絞股藍(lán)粉末1 g，包入濾紙?zhí)?，加入石油?00 mL，索氏提取10 h至石油醚提取液無(wú)色，取出濾紙?zhí)變?nèi)絞股藍(lán)樣品，風(fēng)干至石油醚全部揮發(fā)，得到去除色素和油脂的絞股藍(lán)樣品。

稱取0.5 g去除色素和油脂的絞股藍(lán)樣品，用30 mL 80%的甲醇浸泡過(guò)夜，超聲提取60 min后，提取液減壓蒸干，殘?jiān)铀芙?，以水飽和正丁醇溶液萃?次，每次30 mL，合并萃取液，減壓旋干，以色譜純甲醇定容至10 mL容量瓶，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜即得。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取人參皂苷Rb1、Rb3、Re和Rd對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成濃度為0.1 g/L對(duì)照品溶液，供 LC-MS 分析。

2.3 色譜條件

色譜柱waters acquity HSS T3(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫條件：0～2 min，20% B；2～12 min，20%～28% B；12～14 min，28%～34% B；14～37 min，34%～70% B；37～42 min，70%～80% B。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式；掃描范圍m/z50～1 500；毛細(xì)管電壓3 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度120 ℃；干燥氣溫度550 ℃；干燥氣流量900 L/h；碰撞電壓20～30 V。

2.5 絞股藍(lán)中已知皂苷類物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

根據(jù)國(guó)內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)ChemSpider及相關(guān)研究文獻(xiàn)，收集整理了絞股藍(lán)中已報(bào)道皂苷類物質(zhì)147個(gè)，包括化合物名稱，化學(xué)式，精確質(zhì)量，結(jié)構(gòu)式等信息，建立絞股藍(lán)中已知皂苷數(shù)據(jù)庫(kù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 達(dá)瑪烷型皂苷對(duì)照品質(zhì)譜裂解規(guī)律

文獻(xiàn)報(bào)道皂苷類物質(zhì)液質(zhì)分析一般采用ESI負(fù)離子模式[14,19]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了絞股藍(lán)中皂苷類成分在正、負(fù)離子模式下信號(hào)差異，結(jié)果表明正離子模式下總離子流信號(hào)明顯強(qiáng)于負(fù)離子模式，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在負(fù)離子模式下，即使碰撞能加到60～70 V，絞股藍(lán)皂苷母離子都很難碎裂，離子碎片信息很少，不利于結(jié)構(gòu)的推斷。而在正離子模式下，碰撞能20～30 V，母離子即發(fā)生碎裂，離子碎片信息豐富，裂解規(guī)律性好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇正離子掃描模式。

按2.3，2.4實(shí)驗(yàn)條件，將4個(gè)達(dá)瑪烷型皂苷對(duì)照品溶液進(jìn)液質(zhì)分析，分別采集正離子模式下一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜?？偨Y(jié)達(dá)瑪烷型皂苷的裂解規(guī)律和特征碎片信息。4個(gè)達(dá)瑪烷型皂苷對(duì)照品的結(jié)構(gòu)式示于圖1。

圖1 4個(gè)達(dá)瑪烷型皂苷對(duì)照品的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of 4 reference saponins with damanane type structure

Re、Rb1、Rb3和Rd四種對(duì)照品的混標(biāo)，在正離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖2，二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。由圖2可知，4種對(duì)照品在正離子模式下，分離良好，有明顯的信號(hào)峰。再結(jié)合相同條件下單標(biāo)進(jìn)樣，可以確定四種皂苷Re、Rb1、Rb3和Rd的保留時(shí)間分別為4.27、15.92、17.57、18.63 min。

圖2 對(duì)照品混合液總離子流圖 Fig.2 Total ion chromatogram of mixed reference substances

圖3 Re、Rb1、Rb3和Rd在正離子模式下二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MSMS spectrums of Re,Rb,Rb3 and Rd in positive mode

人參皂苷Re，分子式C48H82O18，m/z947.556 5為Re的母離子峰[M+H]+，與理論值947.557 9差-1.4 mDa。m/z767.495 8為母離子失去一分子葡萄糖和一分子水后形成的碎片離子峰[M+H-Glu-H2O]+，m/z621.435 6為母離子失去一分子葡萄糖、一分子鼠李糖和一分子水后形成的碎片離子峰[M+H-Glu-Rha-H2O]+，m/z441.374 6為母離子失去兩分子葡萄糖、一分子鼠李糖和兩分子水后形成的碎片離子峰[M+H-2Glu-Rha-2H2O]+，m/z423.362 9為母離子失去兩分子葡萄糖、一分子鼠李糖和三分子水后形成的碎片離子峰[M+H-2Glu-Rha-3H2O]+；m/z309.116 1為葡萄糖與鼠李糖相連糖的碎片離子峰[Glu-Rha+H]+；m/z147.065 2為鼠李糖的碎片離子峰[Rha+H]+。

人參皂苷Rb1，分子式C54H92O23，離子m/z1 109.610 5為皂苷Rb1的母離子峰[M+H]+，與理論值1 109.610 7差0.2 mDa。m/z1 091.600 8，929.548 5，767.495 1，605.444 0，425.377 1碎片離子分別對(duì)應(yīng)[M+H-H2O]+，[M+H-Glu-H2O]+，[M+H-2Glu-H2O]+，[M+H-3Glu-H2O]+，[M+H-4Glu-2H2O]+；m/z325.113 1為兩個(gè)葡萄糖相連糖的碎片離子峰[Glu-Glu+H]+；m/z163.060 6為葡萄糖的碎片離子峰[Glu+H]+。

人參皂苷Rb3，分子式C53H90O22，離子m/z1 079.599 1為母離子峰[M+H]+，與理論值1 079.600 2差-1.1 mDa。m/z1 061.585 3，899.533 6，767.492 4，605.443 5，425.377 8碎片離子分別對(duì)應(yīng)[M+H-H2O]+，[M+H-Glu-H2O]+，[M+H-Glu-Xyl-H2O]+，[M+H-2Glu-Xyl-H2O]+，[M+H-3Glu-Xyl-2H2O]+。

人參皂苷Rd，分子式C48H82O18，離子m/z947.556 2為母離子峰[M+H]+，與理論值947.557 9差-1.7 mDa。m/z749.485 1，605.440 8，425.379 6碎片離子分別對(duì)應(yīng)[M+H-Glu-2H2O]+，[M+H-2Glu-H2O]+，[M+H-3Glu-2H2O]+。

綜上所述，達(dá)瑪烷型皂苷因其苷元四環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在正離子模式下其裂解規(guī)律主要為糖苷鍵的斷裂和苷元上羥基脫水，產(chǎn)生的特征碎片分別為母離子失去162(葡萄糖：Glu)，146(鼠李糖：Rha)，132(木糖：Xyl)或18(水：H2O)后形成的。

3.2 黃山野生絞股藍(lán)中皂苷類物質(zhì)分析鑒定

按照2.3，2.4實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣，采集供試品溶液正離子模式下總離子流圖，示于圖4。絞股藍(lán)中皂苷類成分在ESI正離子模式下獲得了良好響應(yīng)和分離。實(shí)驗(yàn)中采用Masslynx軟件分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)合對(duì)照品裂解規(guī)律，文獻(xiàn)報(bào)道，ChemSpider等數(shù)據(jù)庫(kù)，快速鑒定出供試品中含皂苷類物質(zhì)25種，結(jié)果見(jiàn)表1，以下舉例說(shuō)明各類皂苷物質(zhì)鑒定過(guò)程。

圖4 正離子模式下絞股藍(lán)樣品的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of extract from Gynostemma pentaphyllum

3.2.1 利用對(duì)照品鑒別化合物

化合物18(tR=17.55 min)和19(tR=18.66 min)經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，保留時(shí)間分別與對(duì)照品Rb3和Rd相一致，且質(zhì)譜圖(圖5)中主要離子碎片及相對(duì)豐度也與對(duì)照品一致，因此化合物18鑒定為Rb3，化合物19鑒定為Rd。

圖5 化合物18(A)和19(B)正離子模式下質(zhì)譜圖Fig.5 MSMS spectrums of compound 18 (A) and 19(B) in positive mode

3.2.2 利用數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定已知皂苷類化合物

已知絞股藍(lán)皂苷中含有多種同分異構(gòu)體，有些同分異構(gòu)體能從質(zhì)譜圖中加以區(qū)分，有些則很難區(qū)分。如化合物22(tR=21.91 min)與23(tR=22.72 min)具有相同特征離子峰和裂解規(guī)律(見(jiàn)圖6)，分子離子峰均為 801.50 [M+H]+,加合離子峰m/z823.49 [M+Na]+。推斷二者為同分異構(gòu)體，計(jì)算元素組成為C42H72O14。倆化合物均具有相同的特征碎片峰，m/z783.49 [M+H-H2O]+；m/z621.44 [M+H-H2O-Glu]；m/z441.37 [M+H-2H2O-2Glu]+。區(qū)別：對(duì)比倆質(zhì)譜圖，m/z621.44的豐度差別較大，化合物23在m/z621.44的豐度明顯小于化合物22，說(shuō)明化合物22更易失去一分子葡萄糖；且化合物23有比較明顯的m/z325.119 6峰，說(shuō)明化合物23的兩個(gè)葡萄糖是相連的。有研究表明，兩個(gè)單糖鏈很容易失去一個(gè)糖，而由兩個(gè)糖形成的糖鏈?zhǔn)ヒ粋€(gè)糖不如失去兩個(gè)糖穩(wěn)定[19]。結(jié)合文獻(xiàn)，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，可推斷化合物22為：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基2α,3β,12β,20 (S)-3羥基-達(dá)瑪烷24-烯20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，化合物23為Gypenoside LXXIV[12]，其分子示意圖示于圖7。

化合物14(tR=15.80 min)與15(tR=16.20 min)具有相同特征離子峰和裂解規(guī)律(見(jiàn)圖8)，均有相同的m/z1 095.59 [M+H]+，m/z1 117.57 [M+Na]+，推斷二者為同分異構(gòu)體，計(jì)算元素組成為C53H90O23。倆化合物均具有相同質(zhì)譜碎片峰，m/z915.53 [M+H-H2O-Glu]+，783.48 [M+H-H2O-Glu-Xyl]+，m/z621.43 [M+H-H2O-2Glu-Xyl]+，m/z441.37 [M+H-2H2O-3Glu-Xyl]+，m/z163.05[Glu+H]+，m/z295.10 [Glu-Xyl+H]+。兩化合物具有相同的特征碎片，且豐度基本一致，說(shuō)明倆同分異構(gòu)體取代基相同，只是取代基位置異構(gòu)，對(duì)于此類同分異構(gòu)體，質(zhì)譜很難區(qū)別。結(jié)合文獻(xiàn)[9]，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，可推斷化合物14和15可能為L(zhǎng)XIX 或者 LXVII。依據(jù)此方法，共鑒定出17種已知絞股藍(lán)皂苷，其中包含4對(duì)同分異構(gòu)體。

圖6 化合物22(A)和23(B)正離子模式下二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 MSMS spectrums of compound 22 (A) and 23 (B) in positive mode

圖7 化合物22和23結(jié)構(gòu)示意圖Fig.7 Structures of compound 22 and 23

圖8 化合物14(A)和15(B)正離子模式下二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.8 MSMS spectrums of compound 14 (A) and 15 (B) in positive mode

3.2.3 未知苷類化合物的鑒定

化合物5、6、7和11具有相同的分子離子峰m/z995.54 [M+H]+，m/z1 017.53 [M+Na]+，這四種化合物為同分異構(gòu)體，計(jì)算元素組成為C48H82O21。分析二級(jí)質(zhì)譜碎片離子均有m/z815 [M+H-H2O-Glu]+，m/z653 [M+H-H2O-2Glu]+，m/z455 [M+H-3H2O-3Glu]+，符合絞股藍(lán)皂苷質(zhì)譜裂解規(guī)律，比對(duì)絞股藍(lán)皂苷數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到符合化合物。在線檢索ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)得到化合物(2α,3β,12β,23E)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)-25-hydroperoxy-2,12-dihydroxydammar-23-en-3-yl 2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside(ChemSpider ID:58859103)，其結(jié)構(gòu)與該化合物二級(jí)質(zhì)譜特征碎片相符，據(jù)此推測(cè)化合物5、6、7和11為ChemSpider ID:58859103或其同分異構(gòu)體。這是在絞股藍(lán)中首次發(fā)現(xiàn)的化合物。同理可推斷化合物3和9為(3β,6α,12β)-3-{[6-O-(D-Glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]oxy}-24-hydroperoxy-6,12-dihydroxydammar-25-en-20-yl 6-O-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside(ChemSpider ID:24641426)或其同分異構(gòu)體。

表1 黃山野生絞股藍(lán)中皂苷類化合物的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of saponins from wild Gynostemma pentaphyllum in Huangshan

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號(hào)No.tR(min)M+H觀測(cè)值Observed(m/z)化學(xué)式Formula 偏差Error (mD)MSMS特征碎片Characteristic fragments(m/z)鑒定結(jié)果Identification result 1213.63931.563 9C48H82O170.9751(931-18-162)605(931-18-162-146)443(931-18-162-146-162)LXXIII1314.281 079.601 0C53H90O220.8899(1 079-162-18) 737(1 079-162-18-162) 605(1 079-162-18-162-132) 443(1 079-162-18-162-132-162)LXIII1415.801 095.593 1C53H90O23-2.0915(1 095-162-18)783(1 095-162-132-18)621(1 095-162-132-18-162) 441(1 095-162-132-18-162-162-18) LXIX / LXVII1516.201 095.593 6C53H90O23-1.5915(1 095-162-18)783(1 095-162-132-18)621(1 095-162-132-18-162) 441(1 095-162-132-18-162-162-18) LXIX / LXVII1617.111 107.596 5C54H90O231.4945(1 107-162)783(1 107-162-162)621(1 107-162-162-162)459(1 107-162-162-162-162) 1[11]1717.22963.551 4C48H82O19-1.5783(963-18-162) 621(963-18-162-162) 459(963-18-162-162-162) XLVI1817.551 079.598 5C53H90O22-1.7899(1 079-162-18)767(1 079-162-18-132)605(1 079-162-18-162-132)425(1 079-162-18-162-132-162-18)人參皂苷 Rb31918.66947.558 7C48H82O180.8749(947-18-162-18) 605(947-18-162-162)425(947-18-162-162-162-18)人參皂苷 Rd2019.03917.511 5C46H76O180.5737(917-18-162) 605(917-18-162-132)443(917-18-162-132-162) LV2120.50933.541 6C47H80O18-0.7753(933-18-162) 621(933-18-162-132) 441(933-18-162-132-162-18) LXIV2221.91801.499 2C42H72O14-0.8621(801-18-162) 441(801-18-162-162-18)LXXIV2322.72801.498 9C42H72O14-1.1621(801-18-162) 441(801-18-162-162-18) 3-O-β-D-吡喃葡萄糖基2α,3β,12β,20(S)-3羥基-達(dá)瑪烷24-烯20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷2424.69771.488 7C41H70O13-0.8591(771-18-162) 459(771-18-162-132)Gynoside A2526.40783.488 4C42H70O13-1.1621(783-162) 441(783-162-162-18) XXVIII

4 結(jié)論

絞股藍(lán)中皂苷類化合物均為達(dá)瑪烷型皂苷，本研究首先分析了4個(gè)達(dá)馬烷型皂苷對(duì)照品的裂解規(guī)律和特征碎片離子，再依據(jù)其裂解規(guī)律和特征碎片離子，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和數(shù)據(jù)庫(kù)分析鑒定黃山野生絞股藍(lán)中皂苷類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)從黃山野生絞股藍(lán)中共鑒定出25個(gè)皂苷類化合物，其中有6個(gè)化合物在該植物中屬首次發(fā)現(xiàn)，研究可為黃山野生絞股藍(lán)的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

本研究建立了UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)快速分離、鑒定絞股藍(lán)中皂苷類化合物的分析方法，該方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成皂苷類成分分離、鑒定工作，避免了從粗提物純化才能鑒別的繁瑣過(guò)程，為黃山野生絞股藍(lán)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究提供了數(shù)據(jù)支撐。然而該方法也存在一定的局限性，對(duì)于一些同分異構(gòu)體很難區(qū)分，還需要進(jìn)一步結(jié)合核磁共振等技術(shù)進(jìn)行分析。