陳 露，李家明，林志強(qiáng)，鐘鳳林*，許 茹，黃晨馨，周相助，林義章

1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2福建省種子管理總站，福州 350000

紫色小白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.comunisTsen et Lee)屬十字花科蕓薹屬白菜種，是小白菜的變種[1]。該品種葉片正面紫色，背面綠色，葉脈紫色，葉柄翠綠色，富含花青苷，營養(yǎng)價(jià)值高，可作為蔬菜色拉直接食用，深受消費(fèi)者喜愛[2]。有機(jī)酸作為紫色小白菜的主要營養(yǎng)成分之一，具有軟化血管，幫助胃液消化脂肪和蛋白質(zhì)，促進(jìn)鈣、鐵元素的吸收之功效，對(duì)預(yù)防疾病和促進(jìn)新陳代謝等也具有很好的輔助療效[3]。因此，紫色小白菜有機(jī)酸的提取和定量分析具有重要的研究意義。

有機(jī)酸的提取方法主要有水提法、微波萃取法、生物酶提取法和超聲波提取法。其中，超聲波提取法具有提取時(shí)間短、效率高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[4]，已廣泛運(yùn)用于中草藥[5]、黃酮[6]、多糖[7]、花青素[8]等領(lǐng)域。超聲波提取法涉及到物料、超聲時(shí)間、超聲溫度等多種影響因素。響應(yīng)面法在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析各因素交互作用的影響，具合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)良的精密度，在多糖、黃酮、花青素等天然產(chǎn)物的提取都獲得了最佳提取工藝。利用最佳提取工藝，對(duì)紫色小白菜有機(jī)酸的定性定量分析具有重要意義。超高效液相色譜法(UPLC法)測定有機(jī)酸前處理簡單，且能同時(shí)測定多種有機(jī)酸，操作簡單，分析結(jié)果良好，目前已廣泛運(yùn)用于果實(shí)[9]、煙草[10]等領(lǐng)域。本研究針對(duì)紫色小白菜中的有機(jī)酸，采取超聲波提取法結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，并通過UPLC法分析有機(jī)酸組分及含量，旨在探究紫色小白菜有機(jī)酸提取的最優(yōu)工藝條件并進(jìn)行定性定量分析，為深入研究及推廣紫色小白菜的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為京研益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司的‘京研’紫色小白菜。

紫色小白菜于2018年9～11月種植于福建農(nóng)林大學(xué)蔬菜研究所，將新鮮紫色小白菜(切除根系部分)于烘箱內(nèi)110 ℃殺青30 min，然后于70 ℃恒溫條件下烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩后，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC?(美國WATERS公司)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、WATERS?EMPOWER?3分析軟件、QDa檢測器、ACQ-TUV紫外檢測器；ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱，2.1×100 mm，1.7 μm；FW200型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SIGMA 3-30K高速離心機(jī)(美國SIGMA公司)；IKA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 有機(jī)酸浸提的工藝路線

稱取紫色小白菜樣品烘干粉末，按料液比加入乙醇溶劑漩渦震蕩，在一定溫度下超聲輔助提取一段時(shí)間，離心后吸取上清液，洗滌沉淀兩次并合并濾液，將所得濾液蒸發(fā)濃縮即為待測液。

1.3.2 有機(jī)酸提取工藝單因素優(yōu)化試驗(yàn)

紫色小白菜烘干樣品粉末分別對(duì)超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比和超聲溫度4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，各因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of single factor experiment

1.3.3 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)見表2。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行分析，確定紫色小白菜有機(jī)酸提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，并采用最優(yōu)工藝參數(shù)對(duì)紫色小白菜有機(jī)酸提取進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors in RSM experiment

1.3.4 有機(jī)酸含量測定

采用陳琦等[11]沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，在最大吸收波長730 nm下分別測定不同濃度沒食子酸吸光值。以沒食子酸含量C對(duì)吸光度A進(jìn)行回歸，得到回歸方程：A=1.784 4C+0.000 3和相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。按回歸方程計(jì)算總有機(jī)酸含量，計(jì)算公式如下：

其中，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的總有機(jī)酸含量(mg)，VT為提取液總體積(mL)，N為稀釋倍數(shù)，m為紫色小白菜質(zhì)量(g)，VS為測定時(shí)樣品提取液體積(mL)。

1.3.5 有機(jī)酸定性及定量分析

取待測液經(jīng)0.22 μm的水相微孔濾膜過濾，采用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為0.1% 甲酸/水，流動(dòng)相B為0.1% 甲酸/乙腈；流速0.25 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積3 μL；檢測波長210 nm；采用等梯度洗脫程序0～6 min 99% 體積濃度的0.1% 甲酸/水+1% 甲酸/乙腈；掃描方式：負(fù)離子掃描；積分方式：母離子積分。

測得蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙二酸、酒石酸標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y= 24 925x+ 5 835.7(R2= 0.995 4)；y= 34 446x+ 10 370(R2= 0.996 9)；y= 23 113x+ 1 014.3(R2= 0.993 6)；y= 5 472.2x+ 231.13(R2= 0.990 8)；y= 44 233x+2 478.9(R2= 0.996 9)，x代表UPLC-MS中所測定有機(jī)酸的峰面積，y代表所測有機(jī)酸濃度(mg/mL)[12]。經(jīng)計(jì)算獲取供試樣品中的有機(jī)酸類物質(zhì)的含量，計(jì)算公式如下：

其中C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查濃度(mg/mL)；V為樣品定容體積(mL)；M干樣為樣品干重(g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert v8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用DPS(7.05)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用LSD法進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，超聲時(shí)間10 min，乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲溫度70 ℃是紫色小白菜有機(jī)酸提取單因素試驗(yàn)的最優(yōu)條件。如圖1所示，隨著超聲時(shí)間的延長、乙醇濃度的升高、料液比的增加、超聲溫度的上升，有機(jī)酸得率均呈先增加后減少的趨勢。在超聲時(shí)間為10 min時(shí)有機(jī)酸得率達(dá)到最大，超過10 min后，有機(jī)酸得率隨時(shí)間延長而減少。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過長導(dǎo)致其他物質(zhì)的溶出或揮發(fā)性有機(jī)酸發(fā)生降解。乙醇濃度達(dá)到70%后，有機(jī)酸得率隨乙醇濃度的增加而減少。伴隨乙醇濃度的增加，脂溶性色素的含量也會(huì)增加，從而減少有機(jī)酸得率。在料液比為1∶20時(shí)有機(jī)酸得率達(dá)到最大。當(dāng)料液比增加到一定量趨于飽和狀態(tài)后，再增加料液比反而導(dǎo)致其他物質(zhì)的溶出，從而減少有機(jī)酸得率。超聲溫度為70 ℃時(shí)有機(jī)酸得率達(dá)到最大。溫度持續(xù)升高可能會(huì)導(dǎo)致有機(jī)酸類物質(zhì)穩(wěn)定性下降。

圖1 單因素對(duì)有機(jī)酸得率的影響Fig.1 Effects of factors on the yield of organic acids注：A超聲時(shí)間(min)，B乙醇濃度(%)，C料液比(mg/g)，D超聲溫度(℃)。Note:A Ultrasonic time (min),B Ethanol concentration (%),C Ratio of solid to liquid (mg/g),D Ultrasonic temperature (℃).

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探究各因素之間的交互作用對(duì)紫色小白菜有機(jī)酸得率的影響(表3)。以超聲時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)、超聲溫度(D)為影響因素，以有機(jī)酸得率(mg/g)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)(共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中5個(gè)重復(fù)試驗(yàn)點(diǎn)用以估計(jì)誤差)，并通過Design-Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)回歸擬合得到二次回歸方程：

Y=19.95+0.23A+0.48B+0.33C-0.18D+0.11AB+0.097AC-0.032AD-0.23BC+0.24BD-0.13CD-0.79A2-0.78B2-1.16C2-1.33D2。

表3 有機(jī)酸提取的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 The experimental design and results of organic acid extraction

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)紫色小白菜有機(jī)酸得率的回歸模型作出三維響應(yīng)面圖和等高曲線圖(圖2)，每個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析，另外兩個(gè)因素固定在零水平[14,15]。通過三維圖與二維圖可以直觀地將不同因素對(duì)紫色小白菜有機(jī)酸得率的影響及各因素之間交互作用表現(xiàn)出來。響應(yīng)曲面傾斜度越大，坡度越陡，表明該因素對(duì)紫色小白菜有機(jī)酸得率的影響越顯著。等高線形狀越接近橢圓形，表明兩個(gè)因素之間的交互作用對(duì)有機(jī)酸得率的影響越顯著[16,17]。

通過Design-Expert 8.0軟件對(duì)紫色小白菜有機(jī)酸提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析，得到預(yù)測的提取最佳工藝條件：乙醇濃度為73%，料液比為1∶20.6，超聲時(shí)間為10.9 min，超聲溫度為69.5 ℃，此時(shí)預(yù)測

表4 中心組合試驗(yàn)的方差分析Table 4 ANOVA analysis of central composite test

注：**P<0.01；*P<0.05。

有機(jī)酸得率可達(dá)到20.065 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的局限性，將提取工藝條件中乙醇濃度優(yōu)化為73%，料液比為1∶21，超聲時(shí)間為11 min ，超聲溫度為70 ℃ ，在此條件下，重復(fù)試驗(yàn)5次，紫色小白菜中有機(jī)酸的得率為19 .686 mg/g，與預(yù)測值基本符合，證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

2.4 有機(jī)酸定性及定量分析

采用超高效液相色譜法測定紫色小白菜中有機(jī)酸含量，樣品峰圖如圖3。參考周相助[18]有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程及相關(guān)系數(shù)，各有機(jī)酸組分的相關(guān)系數(shù)在0.990 8～0.998之間，表明采用該方法測定有機(jī)酸類組分標(biāo)準(zhǔn)品其濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，可達(dá)到有機(jī)酸類物質(zhì)定性定量分析的要求。通過對(duì)樣品中有機(jī)酸峰圖的分析，定性地確定樣品中的有機(jī)酸，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算紫色小白菜中各有機(jī)酸組分含量[18,19]。

有機(jī)酸作為紫色小白菜中主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，它的種類和含量既和蔬菜的風(fēng)味、品質(zhì)有關(guān)，又為蔬菜加工貯藏提供重要依據(jù)，是一個(gè)重要的品質(zhì)指標(biāo)。通過超高效液相定性及定量分析紫色小白菜可食用部分的有機(jī)酸，葉片和葉柄部位均檢測到五種有機(jī)酸，分別為蘋果酸、檸檬酸、丙二酸、琥珀酸和酒石酸(表5)。葉片中有機(jī)酸濃度從高到低的順序?yàn)椋禾O果酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸和丙二酸，其中蘋果酸、檸檬酸、丙二酸和酒石酸濃度均明顯高于葉柄。葉柄中有機(jī)酸濃度從高到低的順序?yàn)椋禾O果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙二酸和酒石酸。另外，葉片和葉柄部位均未檢測出順烏頭酸和丙酮酸，可能是因?yàn)楹康陀趦x器檢測范圍。

3 結(jié)論

利用超聲輔助提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，針對(duì)超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，建立回歸模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，結(jié)合實(shí)際操作，最終確定紫色小白菜有機(jī)酸提取工藝條件為乙醇濃度73%，料液比1∶21，超聲時(shí)間11 min ，超聲溫度70 ℃ ，在此條件下紫色小白菜中有機(jī)酸的得率為19.686 mg/g。模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小，可用于實(shí)際預(yù)測。另外，通過超高效液相色譜法定性及定量分析紫色小白菜中有機(jī)酸類物質(zhì)，在葉片和葉柄部位均檢測到五種有機(jī)酸，分別為蘋果酸、檸檬酸、丙二酸、琥珀酸和酒石酸，其中蘋果酸含量最高，分別為15.968、5.019 mg/g，其次為檸檬酸。

圖2 各因素交互作用對(duì)有機(jī)酸得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Responses surface and contour plot for the effects of organic acid extraction注：A超聲時(shí)間(min)和乙醇濃度(%)，B超聲時(shí)間(min)和料液比(mg/g)，C超聲時(shí)間(min)和超聲溫度(℃)， D乙醇濃度(%)和料液比(mg/g)，E乙醇濃度(%)和超聲溫度(℃)，F(xiàn)料液比(mg/g)和超聲溫度(℃)。Note:A Ultrasonic time (min) and ethanol concentration (%),B Ultrasonic time (min) and ratio of solid to liquid (mg/g), C Ultrasonic time (min) and ultrasonic temperature (℃),D Ethanol concentration (%) and ratio of solid to liquid (mg/g), E Ethanol concentration (%) and ultrasonic temperature (℃),F Ratio of solid to liquid (mg/g) and ultrasonic temperature (℃).

圖3 超高效液相色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms注：(A)樣品1-紫色小白菜葉片 a：酒石酸、b：蘋果酸、c：丙二酸、d：檸檬酸、e：琥珀酸；(B)樣品2-紫色小白菜葉柄。Note:(A) sample 1-purple cabbage leaves a.tartaric acid;b.malic acid;c.malonic acid; d.citric acid;e.succinic acid(B)sample 1-purple cabbage petioles.

表5 紫色小白菜樣品中有機(jī)酸含量分析(mg/g)Table 5 Analysis of organic acid contents in purple cabbage samples(mg/g)

本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法對(duì)紫色小白菜有機(jī)酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，研究了紫色小白菜有機(jī)酸組分并進(jìn)行定量分析，為紫色小白菜品質(zhì)評(píng)價(jià)提供良好技術(shù)平臺(tái)，為深入研究及推廣紫色小白菜的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。