任善亮，吳 茂，徐露林，劉曉聰，雷思敏，海 萍，楊小龍2,*，高 原*

1宜賓學院化學與化工學院，宜賓 644000；2中南民族大學藥學院，武漢 430074；3重慶大學藥學院創(chuàng)新藥物研究中心，重慶 401331

番石榴(Psidiumguajava)是桃金娘科(Myrtaceae)番石榴屬植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，民間用于治療炎癥、糖尿病、高血壓、發(fā)熱、嘔吐、腹瀉[1-3]。番石榴葉是一種次生代謝產(chǎn)物具有極高“創(chuàng)造系數(shù)”和顯著活性的生物資源。文獻研究表明，含有3,5-二甲?；S基間苯三酚特征結構單元的混源雜萜是從該植物葉中發(fā)現(xiàn)的一類特有結構，這種芐基間苯三酚結構單元能夠與萜烯、黃酮雜合形成多種新穎骨架[3-14]，其中guajadial[7]、psiguadial A[7]、psiguadial B[7]、psiguadial C[8]、psiguadial D[8]對人體肝癌細胞HepG2顯示出很強的抑制作用(IC50=45.62～157.90 nmol/L)。為進一步研究番石榴的藥用物質(zhì)基礎，本文對我國云南產(chǎn)番石榴葉的化學成分進行了系統(tǒng)分離，得到了13個化合物，分別鑒定為4,5-diepipsidial A(1)、psidial A(2)、guajadial(3)、psiguadial A(4)、psiguadial D(5)、α-生育酚(6)、亞油酸(7)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷(8)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(9)、槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(10)、β-谷甾醇(11)、兒茶素(12)、沒食子酸(13)。其中，化合物1為首次從天然產(chǎn)物中分離得到，化合物5對5種人體腫瘤細胞株HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480顯示出較為明顯的抑制活性。

1 儀器和材料

1.1 儀器與試劑

核磁共振光譜儀(Bruker AV-400 MHz和AV-500 MHz)；ZF-1型紫外檢測儀(力辰儀器科技有限公司生產(chǎn))；RE52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-3型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城儀器有限公司)；FA1604A型電子分析天平(河南恒信儀器設備有限公司)；HSGF254薄層層析硅膠厚制備板(HPTLC,8 ± 2 μm ≥ 80%,0.4～0.5 mm，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；柱層析正相硅膠(200～300目，青島海浪硅膠干燥劑有限公司)；半制備型HPLC(AS20005,Dubhe C18column,10 μm,20 × 250 mm，江蘇漢邦科技有限公司)；Sephadex LH-20(Amersham Biosciences,Sweden)。

1.2 實驗材料

番石榴葉于2017年9月采自云南省麗江市華坪縣大興鄉(xiāng)，原植物由中國科學院昆明植物研究所陳渝鑒定為桃金娘科番石榴屬植物番石榴Psidiumguajava，樣品標本存放于宜賓學院化學與化工學院。

2 提取與分離

干燥的番石榴葉5 kg，用95%甲醇在室溫下浸泡提取3次，每次48 h；合并濃縮后，得到浸膏500 g。用硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯(95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，0∶100，甲醇)梯度洗脫，TLC檢測合并后得到10個組分Fr 1-10。Fr 2經(jīng)反復硅膠(石油醚-乙酸乙酯，100∶1→20∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱色譜，及TLC(石油醚-乙酸乙酯-甲酸，50∶2∶0.1)制備，得到化合物1(4 mg)、2(14 mg)、3(45 mg)、4(48 mg)、5(3 mg)。Fr 3經(jīng)過正相硅膠(石油醚-乙酸乙酯，20∶1→5∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析分離，得到化合物6(22 mg)和7(54 mg)。Fr 4經(jīng)正相硅膠(石油醚-乙酸乙酯，5∶1)柱層析分離，得到化合物11(716 mg)。Fr 5經(jīng)過正相硅膠(二氯甲烷-甲醇，20∶1→6∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析分離，得到化合物12(68 mg)和13(144 mg)。Fr 8經(jīng)過正相硅膠(二氯甲烷-甲醇，10∶1→5∶1)和Sephadex LH-20(氯仿-甲醇，1∶1)柱層析，及HPLC(甲醇-水，40%→65%，0 min→30 min，10 ml/min)制備分離，得到化合物8(5 mg，tR=22.3 min)、9(4 mg，tR=22.9 min)、10(6 mg，tR=24.0 min)。

3 結構鑒定

化合物1白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ: 13.48 (1H,s,5′-OH),13.09 (1H,s,7′-OH),10.08 (1H,s,H-14′),10.07 (1H,s,H-15′),7.17～7.30 (5H,m,H-9′,H-10′,H-11′,H-12′,H-13′),4.60 (1H,s,H-15a),4.59 (1H,s,H-15b),3.42 (1H,d,J=10.3 Hz,H-1′),2.29 (1H,dt,J=10.3,4.8 Hz,H-5),2.20 (1H,m,H-9),2.16 (1H,m,H-3a),2.04 (1H,dd,J=13.3,9.2 Hz,H-7a),1.80 (1H,dt,J=14.7,3.9 Hz,H-3b),1.69 (1H,m,H-6a),1.64 (1H,dd,J=10.6,8.2 Hz,H-10a),1.56 (1H,m,H-2a),1.56 (1H,m,H-10b),1.54 (1H,m,H-1),1.47 (1H,m,H-6b),1.20 (3H,s,H3-14),1.05 (1H,m,H-7b),0.99 (6H,s,H3-12,H3-13);13C NMR (CDCl3,125 MHz) (:192.2 (d,C-14′),191.5 (d,C-15′),169.4 (s,C-7′),168.4 (s,C-5′),163.6 (s,C-3′),154.9 (s,C-8),144.1 (s,C-8′),128.4 (s,C-10′,C-12′),128.0 (s,C-9′,C-13′),126.4 (s,C-11′),109.6 (t,C-15),104.9 (s,C-2′),104.2 (s,C-6′),104.1 (s,C-4′),84.7 (s,C-4),57.4 (d,C-1),44.3 (d,C-1′),43.8 (d,C-5),42.1 (d,C-9),38.7 (t,C-10),38.2 (t,C-3),37.2 (t,C-7),33.6 (t,C-6),33.2 (s,C-11),29.5,22.42 (d,C-12,C-13),22.36 (s,C-2),20.1 (s,C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]對照基本一致，故確定化合物1為4,5-diepipsidial A。

化合物2白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.43 (1H,s,H-7′),13.09 (1H,s,H-5′),10.14 (1H,s,H-15′),10.10 (1H,s,H-14′),7.26 (2H,t,J=7.0 Hz,H-10′,H-12′),7.23 (1H,t,J=7.0 Hz,H-11′),7.15 (2H,d,J=7.2 Hz,H-9′,H-13′),5.03 (1H,s,H-15b),5.00 (1H,s,H-15a),4.18 (1H,d,J=5.7 Hz,H-1′),2.57 (1H,dt,J=3.8,13.5 Hz,H-7b),2.42 (1H,m,H-9),2.27 (1H,brd,J=13.5 Hz,H-7a),2.10 (1H,dd,J=13.9,9.3 Hz,H-3b),2.05 (1H,ddd,J=9.5,5.7,2.0 Hz,H-5),1.79 (1H,t,J=10.1 Hz,H-10a),1.62 (1H,m,H-2a),1.60 (1H,m,H-10b),1.53 (1H,m,H-3a),1.47 (1H,m,H-1),1.44～1.62 (2H,m,H2-6),1.38 (1H,m,H-2b),1.16 (3H,s,H3-14),0.98 (3H,s,H3-12),0.96 (3H,s,H3-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6,15]對照基本一致，故確定化合物2為psidial A。

化合物3白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.44 (1H,s,5′-OH),13.06 (1H,s,7′-OH),10.09 (1H,s,H-14′),10.06 (1H,s,H-15′),7.12～7.28 (3H,m,H-10′,H-11′,H-12′),7.11 (2H,d,J=7.2 Hz,H-9′,H-13′),4.54 (1H,s,H-15a),4.03 (1H,s,H-15b),3.38 (1H,d,J=10.3 Hz,H-1′),2.32 (1H,m,H-9),2.23 (1H,m,H-5),2.16 (1H,m,H-3a),1.97 (1H,m,H-3b),1.80～2.00 (4H,m,H-1,H2-7,H-2a),1.68 (1H,m,H-6a),1.50～1.65 (3H,m,H-6b,H2-10),1.45 (1H,m,H-2b),1.26 (3H,s,H3-14),1.01 (3H,s,H3-12),0.98 (3H,s,H3-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]對照基本一致，故確定化合物3為guajadial。

化合物4白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.77 (1H,s,5′-OH),13.54 (1H,s,7′-OH),10.38 (1H,s,H-14′),10.11 (1H,s,H-15′),7.21 (2H,m,H-10′,H-12′),7.13 (2H,m,H-9′,H-13′),7.11 (1H,m,H-11′),4.48 (1H,s,H-1′),2.49 (1H,m,H-10),2.34 (1H,d,J=11.3 Hz,H-5),2.01 (1H,m,H-2a),1.93 (1H,m,H-9β),1.90 (1H,m,H-3a),1.88 (1H,m,H-2b),1.83 (1H,m,H-8β),1.74 (1H,m,H-9α),1.63 (1H,m,H-3b),1.25 (1H,m,H-8α),1.12 (3H,s,H3-15),1.09 (3H,d,J=7.1 Hz,H3-14),0.90 (3H,s,H3-12),0.57 (1H,m,H-7),0.28 (1H,t ,J=10.3 Hz,H-6),0.22 (3H,s,H3-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]對照基本一致，故確定化合物4為psiguadial A。

化合物5白色粉末(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:13.60 (1H,s,5′-OH),13.15 (1H,s,7′-OH),10.10 (1H,s,H-14′),10.08 (1H,s,H-15′),7.32 (2H,m,H-12′,H-13′),7.23 (1H,m,H-11′),7.15 (1H,t,J=7.4 Hz,H-10′),6.78 (1H,d,J=7.7 Hz,H-9′),5.27 (1H,brd,J=11.2 Hz,H-1),4.36 (1H,s,H-1′),3.70 (1H,d,J=7.1 Hz,H-5),2.75 (1H,m,H-2a),2.08 (1H,m,H-2b),2.08 (2H,m,H2-9),1.90 (1H,brd,J=13.3 Hz,H-8a),1.70 (3H,s,H3-14),1.18 (3H,s,H3-12),1.11 (3H,s,H3-13),0.96 (1H,d,J=13.3 Hz,H-8b),0.92 (1H,t,J=7.7 Hz,H-6),0.70 (3H,s,H3-15),0.65 (1H,t,J=9.7 Hz,H-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物5為psiguadial D。

化合物6無色油狀物(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:4.17 (1H,s,2-OH),2.61 (2H,t,J=6.6 Hz,H2-8),2.16 (3H,s,H3-2′),2.11 (6H,s,H3-1′,H3-3′),1.23 (3H,s,H3-4′),0.87 (6H,d,J=6.5 Hz,H3-13′′,H3-16′′),0.85 (3H,d,J=6.5 Hz,H3-14′′),0.84 (3H,d,J=6.5 Hz,H3-15′′);13C NMR (CDCl3,100 MHz)δ:145.5 (s,C-4a),144.5 (s,C-2),122.6 (s,C-4),121.0 (s,C-3),118.4 (s,C-1),117.3 (s,C-8a),74.5 (d,C-6),39.8 (s,C-1′′),39.4 (s,C-11′′),37.4,37.4,37.4,37.3 (d,C-3′′,C-5′′,C-7′′,C-9′′),32.8 (s,C-8′′),32.7 (s,C-4′′),31.5 (s,C-7),28.0 (d,C-12′′),24.8 (s,C-6′′),24.4 (s,C-10′′),23.8 (d,C-4′),22.7 (d,C-16′′),22.6 (s,C-13′′),21.0 (d,C-2′′),20.7 (s,C-8),19.74,19.65 (s,C-14′′,C-15′′),12.2 (s,C-2′),11.8 (s,C-1′),11,3 (s,C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]對照基本一致，故確定化合物6為α-生育酚。

化合物7無色油狀物(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.28～5.43 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),2.77～2.83 (2H,m,H2-11),2.35 (2H,t,J=7.3 Hz,H2-2),2.00～2.11 (4H,m,H2-8,H2-14),1.63 (2H,t,J=6.0 Hz,H2-3),1.20～1.40 (14H,m,7×CH2),0.87 (3H,t,J=6.0 Hz,H3-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]對照基本一致，故確定化合物7為亞油酸。

化合物9黃色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.73 (1H,brs,H-2′),7.57 (1H,brd,J=8.0 Hz,H-6′),6.86 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.39 (1H,brs,H-8),6.19 (1H,brs,H-6),5.15 (1H,d,J=7.0 Hz,H-1′′),3.89 (1H,t,J=7.3 Hz,H-2′′),3.82 (1H,m,H-5′′a),3.80 (1H,m,H-4′′),3.63 (1H,brd,J=7.4 Hz,H-3′′),3.43 (1H,brd,J=11.1 Hz,H-5′′b)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]對照基本一致，故確定化合物9為槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物10黃色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.52 (1H,brs,H-2′),7.48 (1H,brd,J=8.2 Hz,H-6′),6.89 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.38 (1H,brs,H-8),6.19 (1H,brs,H-6),5.46 (1H,s,H-1′′),4.32 (1H,s,H-1′′),3.44～4.37 (5H,m,H-1′′-H-5′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]對照基本一致，故確定化合物10為槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。

化合物11無色針晶(CHCl3)；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.33 (1H,m,H-6),3.50 (1H,m,H-3),0.99 (3H,s,H3-19),0.91 (3H,d,J=6.2 Hz,H3-21),0.79～0.86 (9H,m,H3-26,H3-27,H3-29),0.66 (3H,s,H3-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]對照基本一致，故確定化合物11為β-谷甾醇。

化合物12白色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.83 (1H,brs,H-2′),6.75 (1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),6.71 (1H,brd,J=8.8 Hz,H-6′),5.92 (1H,brs,H-8),5.84 (1H,brs,H-6),4.55 (1H,d,J=7.4 Hz,H-2),3.96 (1H,m,H-3),2.84 (1H,m,H-4α),2.49 (1H,m,H-4β)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]對照基本一致，故確定化合物12為兒茶素。

化合物13白色粉末(CH3OH)；1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.05 (2H,s,H-2,H-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]對照基本一致，TLC檢測結果與對照品沒食子酸一致，故確定化合物13為沒食子酸。

4 抗癌活性測定

采用MTS法[10]評價化合物5對人體腫瘤細胞株HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的體外活性。用含10%胎牛血清培養(yǎng)液(DMEM或RMPI1640)配成單個細胞懸液，以每孔5 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，貼壁細胞提前12 h接種培養(yǎng)。加入待測化合物溶液(固定濃度40 μM初篩，在該濃度對腫瘤細胞生長抑制在50%附近的化合物設5個濃度進入梯度復篩)，每孔終體積200 μL，每種處理均設3個復孔。37 ℃培養(yǎng)48 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加MTS溶液20 μL以及培養(yǎng)液100 μL。繼續(xù)孵育1～4 h，使反應充分進行。選擇490 nm波長，酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad 680)讀取各孔光吸收值，記錄結果，以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法(Reed and Muench法)計算化合物的IC50值，結果見表1。

表1 化合物5的細胞毒活性(IC50,μM)Table 1 Cytotoxicity data of compound 5 (IC50,μM)

由表1可以看出，化合物5對所有人體腫瘤細胞株均顯示出較為明顯的抑制活性，對SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的抑制活性均優(yōu)于陽性對照藥物順鉑(cisplatin)。

5 結論

含有3,5-二甲?；S基間苯三酚特征結構單元的混源雜萜是從桃金娘科植物番石榴葉中發(fā)現(xiàn)的一類罕見結構，這種特征結構單元能夠與萜烯、黃酮雜合形成多種抗腫瘤活性顯著的新奇骨架。從天然產(chǎn)物化學研究角度出發(fā)，番石榴雜萜類次生代謝產(chǎn)物是一類不可多得、具有極高“創(chuàng)造系數(shù)”和顯著生物活性，值得深入研究的寶貴資源。本課題組前期已從越南產(chǎn)番石榴葉中分離得到5個具有抗腫瘤活性的雜萜類化合物guajadials B-F[9,10]，并在提出合理生源假說的基礎上，通過“萜烯-二甲?；g苯三酚-苯甲醛”三分子偶聯(lián)反應，完成了對guajadial B的仿生合成[9]。為進一步研究番石榴的藥用物質(zhì)基礎，本文對我國云南產(chǎn)番石榴葉的化學成分進行了系統(tǒng)分離，得到了13個化合物，包括5個該植物中特有的雜萜成分1～5。其中，化合物1為Lee等[15]在合成番石榴雜萜guajadial 和psidial A時得到的異構化副產(chǎn)物，為首次從天然產(chǎn)物中分離得到；化合物5對5種人體腫瘤細胞株顯示出較為明顯的抑制活性，且對SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW-480的抑制活性均優(yōu)于陽性對照藥物順鉑(cisplatin)。以上研究結果為番石榴葉在抗腫瘤方面的應用提供了科學依據(jù)。