詹 積，徐德平

江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214122

巴戟天(MorindaofficinalisHow)又名雞腸風(fēng)、雞眼藤、黑藤鉆，為雙子葉植物茜草科巴戟天的干燥根，味甘、微澀，性微溫，是我國(guó)著名四大南藥之一[1]。巴戟天提取物作為天然抗氧化劑，它含有蒽醌類物質(zhì)、環(huán)烯醚萜苷類化合物、糖類以及生物堿等有效化學(xué)成分，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、強(qiáng)健筋骨、祛風(fēng)除濕、抗疲勞、抗抑郁等功效[2,3]。其中，蒽醌類成分包括甲基異茜草素-1-甲醚、大黃素甲醚、2-羥基-3-羥甲基蒽醌、甲基異茜草素；環(huán)烯醚萜類成分，如四乙酰車葉草苷酸、四乙酰車葉草苷以及同分異構(gòu)體水晶蘭苷和去車葉草苷酸等；糖類成分，如蔗果三糖、耐斯糖、菊淀粉型低聚糖類等[4-6]。目前對(duì)巴戟天抗疲勞方面的研究國(guó)內(nèi)少見(jiàn)報(bào)道，龍碧波[7]等研究表明巴戟天提取物可延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，能增加小鼠肝糖原含量，降低血清乳酸和尿素氮含量。朱超[8]等研究表明巴戟天具有提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力和心肌線粒體抗氧化酶活性的作用，可以延緩疲勞發(fā)生。可見(jiàn)國(guó)內(nèi)研究?jī)?nèi)容上仍停留在提取和分析作用階段，并未提及巴戟天抗疲勞的功效成分。本文通過(guò)小鼠跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)[3]，來(lái)研究巴戟天提取物對(duì)增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，強(qiáng)壯身體、抗疲勞的影響，同時(shí)也旨在明確抗疲勞的功效成分，為其在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域的研究開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

巴戟天：購(gòu)于安徽亳州中藥材市場(chǎng)；分析純有機(jī)試劑無(wú)水乙醇、濃硫酸、茴香醛、冰醋酸、正丁醇、甲醇(色譜純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GF254硅膠板：山東煙臺(tái)芝罘化工廠；AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化學(xué)工廠產(chǎn)品；Octadecylsilyl(ODS)填料：Nacalai Tosoh Inc；Middle Chromatogram Isolated Gel(MCI GEL)填料：Mitsubishi Chemical Corporation；雄性ICR小白鼠：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

RAT-100型萃取罐：無(wú)錫申科儀器有限公司；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器廠；SHZ-95型循環(huán)水式多用真空泵：上海丞明儀器設(shè)備有限公司；SYB106-100型恒流泵：天津市科器高新技術(shù)公司；AB 204-N精密電子天平：Mettler-Toledo Group；BW-TDW709動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)：上海軟隆科技發(fā)展有限公司；核磁共振儀：Avance 500 MHz,Bruer 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 巴戟天乙醇提取物的制備

稱取巴戟天10 kg，粉碎后過(guò)40目篩，置于100 L提取罐，按1∶10(g/mL)料液質(zhì)量體積比加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取6 h，過(guò)濾，取濾液減壓濃縮，濾渣按上述方法再次醇提，取濾液。合并兩次濾液，減壓濃縮至適宜體積，即為巴戟天乙醇提取物，冷凍保存。向巴戟天醇提后的濾渣中按上述方法加100 L去離子水，并于70 ℃條件下攪拌6 h，重復(fù)提取兩次，過(guò)濾，取濾液減壓濃縮至膏狀物，即為巴戟天水提物，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 巴戟天具有抗疲勞功效的成分分離及鑒定

取適量巴戟天醇提物上AB-8型大孔樹脂柱(10×150 cm)，依次用濃度為10%、45%、75%和95%得乙醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤監(jiān)測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果將具有相同成分得洗脫液合并，將洗脫液分成A(10%洗脫)、B(45%洗脫)、C(75%洗脫)和D(95%洗脫)五個(gè)部分。分別減壓濃縮后，低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量巴戟天水提物，按醇水比為4∶1加入無(wú)水乙醇，并且不斷攪拌使得濃縮液充分醇沉，至酒精濃度達(dá)到70%以上，靜置過(guò)夜，過(guò)濾得到濾液相(E)經(jīng)減壓濃縮至浸膏，以及醇沉相(F)經(jīng)干燥得到固態(tài)顆粒，兩者低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1 巴戟天提取物A、B、C、D、E、F的抗疲勞功效

按2.3動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)A、B、C、D、E和F六個(gè)樣品的抗疲勞功效。其中實(shí)驗(yàn)組分別按劑量1.0 g/kg/天灌胃，小鼠的灌胃體積是0.1 mL/10 g/只。

2.2.2 具有抗疲勞功效成分的分離

取適量具有抗疲勞功效的巴戟天醇提物大孔樹脂柱分離10%乙醇洗脫物(A)上樣到MCI柱(5×100 cm)，依次用去離子水、8%和50%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速10 mL/min，自動(dòng)收集器每管20 mL收集洗脫液，用TLC薄層法跟蹤檢測(cè)洗脫液中的成分，根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)的結(jié)果，分析合并相同組分，得到L(水)、M(8%)和N(50%)三個(gè)部分。按2.3動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定抗疲勞活性組分。將具有抗疲勞活性的部分反復(fù)上樣ODS-A柱(3×100 cm)和ODS-AQ柱(3×100 cm)，不斷分離純化，直至得到4個(gè)單體化合物1～4。

2.2.3 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

得到的4個(gè)單體化合物1、2、3、4，用重水(D2O)為溶劑，經(jīng)1H NMR和13C NMR等光譜方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.3 巴戟天不同組分抗疲勞活性研究

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

三周齡 SPF級(jí)雄性ICR小白鼠，體重16±2.0 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，觀察小鼠狀態(tài)，對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)記和隨機(jī)分組。每組10只，分為空白組與實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M給正常飲用水，灌胃體積是0.1 mL/10 g/只，連續(xù)給藥30天。對(duì)抗疲勞實(shí)驗(yàn)組給以劑量1.0 g/kg/天灌胃，小鼠的灌胃體積是0.1 mL/10 g/只，連續(xù)給藥30天。

2.3.2 訓(xùn)練及測(cè)試方法

2.3.2.1 小鼠跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前一周，在喂食30 min后，先進(jìn)行15 min跑步機(jī)適應(yīng)訓(xùn)練；給藥30 天后，在末次給藥后30 min，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在跑步機(jī)上進(jìn)行動(dòng)物體能測(cè)試。訓(xùn)練和測(cè)試均采用逐漸增加速度與坡度的方法(見(jiàn)表1)，且測(cè)試時(shí)以20 m/min速度使動(dòng)物奔跑直至力竭。若小鼠落入電擊區(qū)，而經(jīng)過(guò)多次電擊仍無(wú)法起身往前跑即判定已經(jīng)力竭，記錄開始跑步至力竭的跑步時(shí)間。過(guò)程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)因受電擊后離開刺激源，繼續(xù)在跑帶上活動(dòng)，此時(shí)通道計(jì)時(shí)繼續(xù)累加。實(shí)驗(yàn)用時(shí)到達(dá)設(shè)定時(shí)間2 h后，實(shí)驗(yàn)停止[9,10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體能較好者電擊次數(shù)相對(duì)較少，而奔跑時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物訓(xùn)練及測(cè)試方案Table 1 Training and measurement plan of laboratory animals

注：10 min之后保持20 m/min速度和10°坡度至結(jié)束。

Note:After 10 min,keep 20m/min speed and 10°degree.

2.3.2.2 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)[4,5]

跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)束24 h后展開負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。給藥30 min后，將小鼠放入水箱(50×50×50 cm)內(nèi)進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)。水深 35 cm，水溫 25±1 ℃，每只小鼠尾部負(fù)重5%體重的鉛皮，記錄小鼠入水至頭部全部入水持續(xù)8 s不能浮出水面的時(shí)間，記為小鼠力竭時(shí)間。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果與討論

3.1 巴戟天醇提物和水提物不同組分的抗疲勞功效研究結(jié)果

各組小鼠體重變化、跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)力竭時(shí)間和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)力竭時(shí)間的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，各給藥組中，只有A組小鼠較空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后的體重變化明顯增加(P<0.05)。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方面，小鼠跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間顯著增加(P<0.05),負(fù)重游泳力竭時(shí)間顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明A組(大孔樹脂10%乙醇洗脫組分)含有具有強(qiáng)壯、抗疲勞的活性成分。B組、C組、D組、E組和F組小鼠跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間和負(fù)重游泳力竭時(shí)間與空白組相比均無(wú)顯著改善，說(shuō)明不含抗疲勞活性成分?；诖耍瑢?duì)巴戟天醇提物大孔樹脂10%乙醇洗脫物(A)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

表2 樣品A～F對(duì)小鼠體重、跑臺(tái)測(cè)試和負(fù)重游泳的影響Table 2 Effect of A-F from M.officinalis on body weight,running time and swimming time (n =

注：與空白對(duì)照組比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.2 巴戟天醇提物正丁醇萃取相經(jīng)MCI柱分離得各組分得抗疲勞功效研究結(jié)果

各組小鼠體重變化、跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)力竭時(shí)間和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)力竭時(shí)間的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，各給藥組中，只有L組小鼠實(shí)驗(yàn)前后的體重變化相較于空白組的增長(zhǎng)趨勢(shì)更顯著(P<0.05)。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方面，L組小鼠跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間增加非常顯著(P<0.01),負(fù)重游泳力竭

時(shí)間也增加非常顯著(P<0.01)，說(shuō)明L組(MCI柱分離水洗脫部分)含有具有抗疲勞的活性成分。M、N組小鼠跑臺(tái)測(cè)試力竭時(shí)間和負(fù)重游泳力竭時(shí)間與空白組相比均無(wú)顯著提高，說(shuō)明不含抗疲勞活性成分?；诖?，將MCI柱水洗脫物依次反復(fù)上ODS-A和ODS-AQ分離柱，TLC法跟蹤檢測(cè)，直至得到4個(gè)單體化合物1、2、3、4。

表3 樣品L、M、N對(duì)小鼠體重、跑臺(tái)測(cè)試和負(fù)重游泳的影響Table 3 Effect of L,M and N on body weight,running time and swimming time (n =

注：與空白對(duì)照組比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.3 化合物1、2、3、4的結(jié)構(gòu)分析

化合物1 為淺黃色結(jié)晶，易溶于水，微溶于乙醇、甲醇，吸濕性強(qiáng)。從1H NMR(500 MHz，D2O)可見(jiàn)：(5.4(1H，d，J=4.5)為葡萄糖上的端基H信號(hào)；其余均為糖上H信號(hào)。從13C NMR可見(jiàn)：δ105.8、δ105.9、δ105.7、δ95.1有4個(gè)碳信號(hào)，這4個(gè)碳應(yīng)為糖的端基碳信號(hào)，δ60～δ84共有20個(gè)碳信號(hào)，可以判斷為四糖。結(jié)合135DEPT可見(jiàn)，只有δ95.1有信號(hào)峰，表明其余三個(gè)糖為呋喃果糖。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[5-8]，數(shù)據(jù)基本一致，依此判定該化合物1為耐斯糖。

化合物2 不定型白色粉末，易溶于水、甲醇，可溶于甲醇、丙酮等，難溶于氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑，吸濕性較強(qiáng)。

從1H NMR(500 MHz，D2O)可見(jiàn)：δ7.4(1H，s)和δ6.0(1H，s)為雙鍵上的H信號(hào)；δ4.9(1H，d，J=11.5)為葡萄糖上的端基H信號(hào)。

從13C NMR可見(jiàn)： δ152.0、δ153.7、δ131.4、δ117.2有四個(gè)碳信號(hào)，應(yīng)為兩個(gè)雙鍵上的碳信號(hào)。δ101.6、δ75.6、δ78.4、δ72.2、δ78.8、δ62.9有六個(gè)碳信號(hào)，應(yīng)該是葡萄糖基上的碳信號(hào)。結(jié)合135DEPT可見(jiàn)，δ131.4、δ102.9、δ101.6、δ47.4、δ44.3有5個(gè)-CH-信號(hào)，δ72～δ78為葡萄糖基4個(gè)-CH-信號(hào)，δ63.3、δ62.9有2個(gè)-CH2-信號(hào)。13C核磁共振詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。綜合分析，該化合物為環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類化合物，經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[5-8]，并分析得出化合物2為4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷。

化合物3不定型淺棕黃色粉末，易溶于水、甲醇，可溶于甲醇、丙酮等，難溶于氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑，吸濕性較強(qiáng)。

從1H NMR(500 MHz，D2O)可見(jiàn)：δ7.2(1H，s)和δ5.8(1H，s)為雙鍵上的H信號(hào)；δ5.3(1H，d，J=7.0)為葡萄糖基上的端基H 信號(hào)。

從13C NMR可見(jiàn)：該化合物與化合物Ⅱ類似，含有葡萄糖基碳信號(hào)。δ150.7、δ143.9δ、δ131.8、119.5有四個(gè)碳信號(hào)，應(yīng)為兩個(gè)雙鍵碳信號(hào)。δ198.0為羰基碳信號(hào)，δ25.7為甲基碳信號(hào)，故推測(cè)有結(jié)構(gòu)CH3C=O-。結(jié)合135DEPT可見(jiàn)，δ150.7、δ101.3、δ131.8、δ98.8、δ49.0、δ40.9、δ37.3為六個(gè)-CH-信號(hào)， δ78.9～δ72.2為葡萄糖基上四個(gè)-CH-信號(hào)，δ63.3、δ62.4、δ40.9為三個(gè)-CH2-信號(hào)，δ25.7為一個(gè)-CH3-信號(hào)。13C核磁共振詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。綜合分析，該化合物為環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類化合物，經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[5-8]，并分析得出化合物3為4-乙?；?8-羥甲基-3,7-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷。

化合物4 不定型淺棕黃色粉末，易溶于水，易溶于水、甲醇，可溶于甲醇、丙酮等，難溶于氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑，吸濕性較強(qiáng)。

從1H NMR(500 MHz，D2O)可見(jiàn)：δ7.2(1H，s)和δ5.9(1H，s)為雙鍵上的H信號(hào)；δ5.5(1H，s)為葡萄糖基上的端基H信號(hào)。

從13C NMR可見(jiàn)：從13C NMR可見(jiàn)：該化合物與化合物2類似，含有葡萄糖基碳信號(hào)。δ151.7、δ150.9、δ128.3、δ116.6有四個(gè)碳信號(hào)，應(yīng)為兩個(gè)雙鍵碳信號(hào)。δ177.4為羧基碳信號(hào)；δ176.6為羰基碳信號(hào)，δ23.5為甲基碳信號(hào)，故推測(cè)有CH3C=O-結(jié)構(gòu)。結(jié)合135DEPT可見(jiàn)，δ150.9、δ128.3、δ101.1、δ98.2、δ85.8、δ48.5、δ43.2為七個(gè)-CH-信號(hào)，δ78.9～δ72.2為葡萄糖基上四個(gè)-CH-信號(hào)，δ63.3、δ62.0為兩個(gè)-CH2-碳信號(hào)，δ23.5為一個(gè)-CH3-碳信號(hào)。13C核磁共振詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。綜合分析，該化合物為環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類化合物，經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[5-8]，并分析得出化合物4為4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-10-乙?；?3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷。

對(duì)于巴戟天環(huán)烯醚萜苷的研究，廣州中醫(yī)藥大學(xué)李遠(yuǎn)彬[5]、黃珍珍等[6]分離得到水晶蘭苷、乙酰車葉草苷酸和車葉草苷酸。但在本文研究鑒定圖譜中分析并未分離出相同化合物。

表4 化合物2、3、4的13C核磁共振數(shù)據(jù)Table 4 13C NMR Spectroscopic Data of Compound 2,3 and 4

通過(guò)以上測(cè)定分析2、3、4三種化合物的結(jié)構(gòu)如圖2所示：

圖1 化合物2、3、4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 2,3 and 4

4 結(jié)論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴戟天醇提物大孔樹脂10%乙醇洗脫物經(jīng)MCI分離，水洗脫組分對(duì)小鼠抗疲勞有顯著作用。對(duì)MCI柱水洗脫物進(jìn)一步分離得到1、2、3、4四個(gè)化合物，經(jīng)NMR鑒定，分別為耐斯糖(1)、4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷(2)、4-乙?；?8-羥甲基-3,7-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷(3)、4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-10-乙?；?3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷(4)。化合物1耐斯糖屬于寡糖類，并不具有抗疲勞功效。本文首次報(bào)道化合物2、3、4是從巴戟天具有抗疲勞功效部位中分離、鑒定的環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)。但有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明巴戟天抗疲勞的主要功效成分及其抗疲勞的作用機(jī)制。