黃安妮,閆 鶴

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510641)

母豬子宮內(nèi)膜炎癥是目前規(guī)模化豬場較為常見生殖道疾病之一[1],該病發(fā)病率高,50%以上的母豬繁殖性疾病是由子宮內(nèi)膜炎引起的[2]。該病一般是由于病原菌進(jìn)入母豬子宮內(nèi),黏附在子宮黏膜破損處,引起母豬子宮黏膜表層或深層發(fā)生黏液化或者化膿性炎癥[3],患病母豬會在陰道或外陰處發(fā)現(xiàn)有粘性或膿性分泌物[4]?；甲訉m內(nèi)膜炎癥會嚴(yán)重影響母畜發(fā)情周期,導(dǎo)致屢配不孕,即使偶爾配上也會產(chǎn)弱豬、死胎、木乃伊胎或假孕,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響豬群的健康[1]。

準(zhǔn)確掌握母豬生殖道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)情況對更好地、有針對性的治療母豬子宮內(nèi)膜炎至關(guān)重要[5]。陰道是一個開放性腔道,是重要的微生態(tài)區(qū)系,有眾多的微生物棲居于此,正常陰道腔內(nèi)的微生物與宿主、環(huán)境保持著協(xié)調(diào)的、動態(tài)的平衡[6]。相關(guān)研究表明,陰道微環(huán)境平衡對維持其自凈及宿主健康起著重要作用[7],是宿主抵御致病菌或條件致病茵的一道重要的生物學(xué)屏障[8]。

到目前為止,豬的陰道微生物群通常只通過細(xì)菌培養(yǎng)確定,然而,自然環(huán)境中只有不到1%的微生物能用常規(guī)培養(yǎng)方法檢測到[9],同時由于母豬陰道菌群多為厭氧菌或兼性厭氧菌[10],營養(yǎng)要求苛刻,因此使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以全面地認(rèn)識陰道菌群分布[11]。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn),使得微生物組學(xué)的研究更加全面和準(zhǔn)確。本文利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對健康產(chǎn)仔后母豬和患子宮內(nèi)膜炎母豬的陰道菌群進(jìn)行分析,以探究患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道可能存在的病原。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2017年9月廣東省某規(guī)?；i場多頭母豬出現(xiàn)產(chǎn)仔后準(zhǔn)備再次受孕時陰道流膿現(xiàn)象,隨機(jī)取其中3頭母豬的陰道黏液,用無菌陰道棉拭子于陰道取分泌物,避免接觸到陰道口和外陰部以防污染,取出后立即放入2.0 mL無菌離心管中,將離心管放入干冰中,帶回實驗室保存在-80℃冰箱,提取總基因時取出。用同樣的陰道拭子采集方法收集同一豬場產(chǎn)后體況良好、無子宮內(nèi)膜炎和繁殖病史的母豬陰道樣本10份。

1.2 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 利用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN,Germany)提取微生物總DNA,DNA濃度和純度利用NanoDrop 2 000進(jìn)行檢測,DNA質(zhì)量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測;用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對 V3 ～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3 min;然后95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共27個循環(huán);最后72℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp?9 700型)。 擴(kuò)增體系為 20 μL,4 μL 5?FastPfu 緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL 引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu 聚合酶;10 ng DNA模板。

1.3 Illumina Miseq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(Illumina,San Diego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。利用 Illumina公司的 MiseqPE300平臺進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控,用FLASH軟件進(jìn)行拼接：去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列;引物允許2個堿基的錯配,去除模糊堿基;根據(jù)重疊堿基Overlap將兩端序列進(jìn)行拼接,Overlap需大于10 bp,去除無法拼接的序列。利用UCHIME軟件剔除嵌合體,采用RDP classifier(置信度閾值為0.7)對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。選擇Silva作為參考基因組數(shù)據(jù)庫。使用Mothur軟件計算樣本Alpha多樣性指數(shù)?；贐ray-Curtis算法計算樣本間距離,并根據(jù)該距離對樣本進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。利用Wilcoxon rank-sum test檢驗方法檢測兩組母豬陰道微生物群落物種差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)仔后健康母豬與患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道菌群多樣性比較 13份陰道拭子樣本經(jīng)測序后共得到628 807條有效序列數(shù),序列平均長度為413.12 bp,群落覆蓋度超過99.19%,表明所有樣本的測序深度足夠,可以反映樣本的微生物信息。兩組樣本Alpha多樣性分析如表1所示,Sobs,Ace和Chao指數(shù)用來估算樣品中微生物豐富度,與健康組相比,患子宮內(nèi)膜炎組陰道菌群豐富度水平升高,且兩組間有顯著性差異(P＜0.001)。同時,表中Shannon指數(shù)對比說明患病組母豬陰道菌群的多樣性高于健康組?；贐ray-Curtis距離的PCoA分析(Principal co-ordinates analysis)比較兩組的群落結(jié)構(gòu)差異。主坐標(biāo)成分(PC1,PC2和PC3)占有70.59%的樣本組成差異,表明健康母豬與患子宮內(nèi)膜炎母豬的陰道菌群組成是可以相互區(qū)分的,而組間個體微生物菌群組成相似(見封三彩版圖1)。

表1 兩組樣本Alpha多樣性分析

2.2 菌群群落結(jié)構(gòu)門水平組成分析 在門水平,健康組共鑒定出5個相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌門,患病組鑒定出8個優(yōu)勢菌門,見封三彩版圖2A。健康組中厚壁菌門(Firmicutes)占總數(shù)的55.14%,其次擬桿菌門(Bacteroidetes)占15.89%,變形菌門(Proteobacteria)占14.40%,放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)分別為9.90%和3.59%,優(yōu)勢菌門豐度總計可達(dá)到98.92%?；甲訉m內(nèi)膜炎組的優(yōu)勢菌門有：變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和未分類菌門(Unclassified_k_norank),平均相對豐度分別為73.49%、7.89%、5.24%、4.34%、1.94%、1.86%、1.65%和1.44%,合計占總細(xì)菌量的97.84%。其中患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道菌群中的變形菌門顯著高于健康母豬陰道樣本(P＜0.05),而厚壁菌門和梭桿菌門的相對豐度顯著低于健康樣本(P＜0.05)(見封三彩版圖3A)。

2.3 菌群群落結(jié)構(gòu)屬水平組成分析 在屬水平總共檢測到了794種菌屬,其中健康組共有546種,患病組有571種。相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬在健康組與患病組中各有23種和10種,其中僅有葡萄菌屬為共同優(yōu)勢菌屬,在健康組占比為3.23%,低于疾病組的3.85%(見封三彩版圖2B)。健康組的鏈球菌屬是其陰道菌群內(nèi)含量最高的菌屬,占總數(shù)的 7.04%,梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、擬桿菌屬(Bacteroides)、放線桿菌(Actinobacillus)和幽門螺旋菌(Terrisporobacter)也在健康組高表達(dá),且相對豐度均顯著高于患子宮內(nèi)膜炎樣本(P＜0.05)見封三彩版圖3B?；疾〗M中Burkholderia-Paraburkholderia的相對豐度最高,達(dá)41.65%,顯著高于健康組。除Burkholderia-Paraburkholderia外,僅有沙雷菌屬(Serratia)、腸桿菌科-未分類(unclassified_f__Enterobacteriaceae)和葡萄球菌屬等少數(shù)菌屬在患病組中的豐度顯著高于健康組(P＜0.05)(見封三彩版圖3B)。

3 討論

本試驗利用Illumina高通量測序技術(shù)分析患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道菌群結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生伴隨著陰道微生物菌落組成結(jié)構(gòu)的顯著變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),患病組母豬陰道菌群多樣性與豐富度指數(shù)均高于健康組,表明患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道菌群結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。類似的,許蘇容等[11]運用高通量測序?qū)τg期女性陰道菌群多樣性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)健康育齡期女性菌群多樣性顯著高于細(xì)菌性陰道病患者。

本研究揭示出健康母豬陰道菌群在門水平上主要富集厚壁菌門,擬桿菌門,變形菌門,放線菌門和梭桿菌門,這5個菌門是Lorenzen等的研究中健康G?ttingen迷你豬陰道菌群的優(yōu)勢菌門[10],結(jié)果也與Jun Wang等對健康母豬陰道菌群的研究相似[4]。患子宮內(nèi)膜炎后的母豬,變形菌門占比顯著增加,而該門包含有大量致病菌,例如Escherichia,Shigella,Burkholderia[12]。除變形菌門外,其余4個健康組的優(yōu)勢菌門在患病后相對豐度均相應(yīng)降低,這與Jun Wang等[4]的研究結(jié)果存在一定差異,Jun Wang等在對4頭健康母豬與4頭患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道菌群測定時發(fā)現(xiàn)：厚壁菌門在健康組中相對豐度顯著高于疾病組,變形菌門在患病組樣品中上升為優(yōu)勢菌門,擬桿菌門和梭菌門在患病組的相對豐度均要高于健康組。不同實驗室測定結(jié)果的不一致,可能與豬品種即遺傳背景、飼養(yǎng)環(huán)境及飼料的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

一般認(rèn)為,引起母豬子宮內(nèi)膜炎的致病菌為葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、大腸桿菌(Escherichia Coli)等[13-15]。Jun Wang等[4]分析患子宮內(nèi)膜炎母豬陰道菌群,也發(fā)現(xiàn)在患病組中埃希氏-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、葡萄球菌屬等含量均高于健康組。然而本研究結(jié)果顯示,鏈球菌屬、大腸志賀氏菌屬在健康組中占比更高,葡萄球菌屬在兩組間含量相近,因此,我們認(rèn)為該批次母豬子宮內(nèi)膜炎癥不是由上述3種致病菌引起的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Burkholderia-Paraburkholderia在疾病組的平均相對豐度高達(dá)41.65%,在健康組中檢出率為0,是患病組中檢測到的特有菌屬,可能是導(dǎo)致該批次母豬患子宮內(nèi)膜炎的主要原因。伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)包含大量菌種,包括許多與臨床、植物相關(guān)的病原菌,以及與環(huán)境相關(guān)菌種[16]。伯克霍爾德氏菌近年被一些研究進(jìn)一步細(xì)分為Burkholderia,Paraburkholderia兩種菌屬,與臨床、植物相關(guān)的病原菌可歸為Burkholderia,與環(huán)境相關(guān)菌可歸為Paraburkholderia[16]。本研究未細(xì)分到菌種,因此用Burkholderia-Paraburkholderia概述。伯克霍爾德氏菌中部分菌種可引起感染病和炎癥等[17-18],在人陰道菌群的報道中就發(fā)現(xiàn),fungorum伯克霍爾德氏菌(Burkholderia fungorum)可能是和人的細(xì)菌性陰道炎相關(guān)的細(xì)菌[19-20]。這是首次發(fā)現(xiàn)Burkholderia-Paraburkholderia可能是引起母豬的子宮內(nèi)膜炎的主要因素。

綜上所述,本研究通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了患子宮內(nèi)膜炎母豬與健康母豬陰道菌群的差異,其中Burkholderia-Paraburkholderia豐度的增加可能與母豬的子宮內(nèi)膜炎癥密切相關(guān)。研究為患子宮內(nèi)膜炎癥母豬的預(yù)防及治療提供依據(jù)。