靳倩蘭,王夢(mèng)玲,杜孟澤,朱要宏,王九峰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

奶牛分娩后子宮腔內(nèi)極易受到來自環(huán)境中細(xì)菌的污染,子宮復(fù)舊、子宮防御機(jī)制的建立和子宮內(nèi)膜再生能夠清除這些細(xì)菌。如果致病菌不能及時(shí)被清除,持續(xù)存在的致病菌會(huì)引起多達(dá)50%的奶牛發(fā)生子宮炎癥,包括子宮炎、臨床型和亞臨床型子宮內(nèi)膜炎[1]。子宮疾病損傷奶牛繁殖力,造成受胎率降低、產(chǎn)后空懷期延長(zhǎng)、不孕牛淘汰率增加,同時(shí)乳產(chǎn)量下降、治療費(fèi)用增加以及因抗生素治療導(dǎo)致棄奶等,給奶牛產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,一個(gè)奶牛子宮炎的病例的花費(fèi)可達(dá)292歐元;按20%發(fā)病率計(jì)算奶牛子宮疾病可分別造成歐盟和美國(guó)奶業(yè)每年高達(dá)14億歐元和6.5億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

革蘭陽性菌化膿隱秘桿菌是最常分離到的主要子宮致病菌之一,進(jìn)入牛子宮會(huì)破壞子宮內(nèi)膜上皮[1]。這是由于化膿隱秘桿菌分泌一種膽固醇依賴性細(xì)溶細(xì)胞素(Pyolysin,PLO),能夠插入細(xì)胞膜富含膽固醇的脂筏中形成30 nm的孔洞,導(dǎo)致細(xì)胞滲透性死亡[3]。雖然已經(jīng)證實(shí)化膿隱秘桿菌與子宮內(nèi)膜炎的嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)性,但健康牛子宮中也能分離到該細(xì)菌[4]。plo基因作為主要的致病因子在化膿隱秘桿菌中是普遍存在的[5],因此它有可能不是唯一起決定性作用的致病因子。化膿隱秘桿菌或plo基因缺失菌株能夠刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)IL-1β,IL-6和IL-8,但單獨(dú)PLO毒素并不會(huì)刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞、造血細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[3]。因此化膿隱秘桿菌引起的子宮內(nèi)膜炎癥可能與其表達(dá)其他毒素有關(guān)。

本試驗(yàn)采集產(chǎn)后3周內(nèi)健康與患子宮炎奶牛的子宮分泌物進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定,并且對(duì)于化膿隱秘桿菌分離株進(jìn)行了毒力基因檢測(cè),了解產(chǎn)后子宮中可培養(yǎng)的細(xì)菌,調(diào)查比較產(chǎn)后健康奶牛和患子宮炎奶牛子宮中的化膿隱秘桿菌分離情況及其攜帶的毒力基因,為下一步研究化膿隱秘桿菌對(duì)子宮內(nèi)膜的致病機(jī)理提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

1.1 主要試劑 血平板所用綿羊血,購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;LB瓊脂,購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR體系,購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備 TCYQ型恒溫振蕩培養(yǎng)箱,購自太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;SW-CJ-1FD型單人單面垂直凈化工作臺(tái),購自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司;DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱,購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Model#：9902型PCR儀,購自美國(guó)ABI公司;DYY-6C型電泳儀,購自北京市六一儀器廠;凝膠成像儀,購自美國(guó)Alpha Innotech公司;立式高壓蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SⅡ,購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣本采集與處理 于北京市某奶牛場(chǎng)選定產(chǎn)后3周內(nèi)的奶牛采集子宮分泌物,并記錄奶牛個(gè)體的年齡、病史、用藥、體況評(píng)分等信息,并對(duì)子宮分泌物進(jìn)行評(píng)分。曾有抗生素、中草藥治療病史的奶牛未采樣。由獸醫(yī)采用直腸把握法,將帶有固定探針的子宮分泌物采集導(dǎo)管從陰門插入到子宮頸口內(nèi)。導(dǎo)管頂端沖破外層保護(hù)薄膜后穿過子宮頸口進(jìn)入宮腔內(nèi),使氣囊充氣從而固定導(dǎo)管位置防止子宮分泌物外流。隨后取出固定探針后用50 mL注射器抽取子宮分泌物,收集于滅菌的50 mL離心管中,冰上運(yùn)輸4 h內(nèi)達(dá)到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物培養(yǎng)。

2.2 子宮分泌物評(píng)分 對(duì)產(chǎn)后21 d內(nèi)奶牛子宮分泌物的評(píng)分依據(jù)[6]如下：1分：沒有惡臭氣味的惡露,無色、紅色或棕色;2分：渾濁且含有絮狀膿黏液的分泌物;3分：含有＜50%粘膿性物質(zhì)的分泌物,沒有惡臭氣味;4分：含有≥50%粘膿性物質(zhì)的分泌物,沒有惡臭氣味;5分：惡臭,紅色或者褐色的水性分泌物。子宮分泌物評(píng)分在4分及以下的奶牛被診斷是健康的,子宮分泌物被評(píng)為5分的奶牛且直腸溫度≥39.5℃被診斷為患子宮炎。

2.3 細(xì)菌分離鑒定 (1)將子宮分泌物涂于血平板：取樣品以原液和10倍稀釋的濃度分別接種于血平板上均勻涂布,37℃培養(yǎng)箱需氧培養(yǎng)48 h;(2)取血平板中單一菌落,進(jìn)行16S rDNA通用引物PCR后,測(cè)序。 上游引物序列：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′,下游引物序列：5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′,目的條帶 1 465 bp;(3)利用NCBI中BLAST數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2.4 DNA提取與毒力基因鑒定 單一菌落多次分離純培養(yǎng)后,使用天根生化科技(北京)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。取1 μL模板使用北京博邁德基因技術(shù)有限公司PCR Mix體系進(jìn)行常規(guī)PCR。擴(kuò)增循環(huán)執(zhí)行條件如下：95℃10 min(15 s循環(huán)40次),退火30 s,延伸72℃30 s：72℃擴(kuò)增4 min。利用電泳凝膠技術(shù)將分離出來的化膿隱秘桿菌進(jìn)行毒力基因鑒定,引物由天一輝遠(yuǎn)試劑公司合成,參考Silva合成引物[5],引物序列見表1。

表1 化膿隱秘桿菌的毒力基因引物序列

3 結(jié)果

3.1 奶牛個(gè)體信息 根據(jù)臨床診斷結(jié)果,健康奶牛有15頭,平均年齡為3.8歲,子宮分泌物評(píng)分為2.143±0.312,體況評(píng)分為3.15±0.036,其中8頭牛子宮分泌物分離到化膿隱秘桿菌;子宮炎奶牛11頭,平均年齡為5歲,子宮分泌物評(píng)分為4.091±0.315,體況評(píng)分為3±0.097,其中7頭牛子宮分泌物分離到化膿隱秘桿菌。

3.2 細(xì)菌分離結(jié)果 根據(jù)血平板培養(yǎng)結(jié)果、單菌落16S rRNA鑒定結(jié)果,本試驗(yàn)從26份子宮分泌物樣品中共分離出87株細(xì)菌,共10個(gè)屬。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)(表2),其中分離到大腸桿菌最多,共分離到34株,分別從8頭患子宮炎奶牛、13頭健康牛中分離得到?；撾[秘桿菌分離得到17株,來自7頭子宮炎病牛和9頭健康牛。芽孢桿菌共分離到15株,包括蠟樣芽孢桿菌(6株),地衣芽孢桿菌(4株),短小芽孢桿菌(2株),枯草芽孢桿菌(2株)等。結(jié)果表明,大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、芽孢桿菌是產(chǎn)后3周內(nèi)奶牛子宮中最常分離到的細(xì)菌,而葡萄球菌、梭桿菌、咸海鮮球菌、海藻希瓦菌、食酸菌、創(chuàng)傷球菌及彭氏變形桿菌也在個(gè)別牛子宮中偶見分離。分析每頭牛感染情況,其中6頭牛屬于單一感染,包括3頭健康牛(均為大腸桿菌)和3頭患子宮炎牛(1頭為化膿隱秘桿菌,2頭牛為大腸桿菌);其他20頭奶牛均為多細(xì)菌混合感染。

表2 子宮分泌物中細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

3.3 化膿隱秘桿菌毒力基因鑒定 中插彩版圖1示化膿隱秘桿菌在血平板上的菌落形態(tài)：菌落直徑1 mm,呈白色透明、凸起、圓形、邊緣整齊,周圍1 mm透明溶血環(huán)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(表3),從11頭患子宮炎的奶牛和15頭健康牛的子宮分泌物中共分離得到17株化膿隱秘桿菌,且均攜帶plo基因和fimA基因,其中攜帶最多毒力基因的化膿隱秘桿菌分別在健康和子宮炎奶牛中分離到1株和3株。圖2示化膿隱秘桿菌毒力基因電泳凝膠結(jié)果。

表3 化膿隱秘桿菌毒力基因結(jié)果

4 分析與討論

根據(jù)近年來子宮內(nèi)細(xì)菌分離培養(yǎng)并結(jié)合細(xì)菌致病性,Sheldon等人將常分離到的子宮細(xì)菌歸納總結(jié)為以下3類：第一類,公認(rèn)的致病菌,包括化膿隱秘桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)黑色素普菌、壞死梭桿菌以及具核梭桿菌;第二類,潛在的致病菌,包括不動(dòng)桿菌、地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、多殺巴氏桿菌、嗜血桿菌、凝固酶陽性金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、擬桿菌、厚壁菌門和所菌門某些細(xì)菌種等;第三類,非子宮致病菌包括克雷伯菌、微球菌、變形桿菌,以及某些葡萄球菌屬等[6]。

從產(chǎn)后3周內(nèi)健康和患子宮炎奶牛采集的26份子宮分泌物中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、芽孢桿菌是最常分離到的細(xì)菌,這與前人的研究結(jié)果基本一致[7,9]。通常認(rèn)為產(chǎn)后一周內(nèi)大腸桿菌的大量繁殖是子宮感染和炎癥的第一步,子宮穩(wěn)態(tài)被破壞后更利于其他厭氧致病菌的侵襲感染,包括化膿隱秘桿菌、壞死梭桿菌、擬桿菌等[8]。然而本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)3頭健康牛和2頭患子宮炎牛子宮中存在大腸桿菌單一感染的情況,這可能與大腸桿菌容易成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有關(guān)。目前本試驗(yàn)中應(yīng)用的細(xì)菌培養(yǎng)方法導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)要求苛刻或未知培養(yǎng)條件的細(xì)菌無法被培養(yǎng)分離到,將來采用細(xì)菌16S rNA基因高通量測(cè)序可以反映子宮完整的細(xì)菌組成。另外,芽孢桿菌也是子宮分泌物中較常分離到的細(xì)菌,包括短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等,這與Wagener K.的研究結(jié)果一致[9]。但黃啟震等人發(fā)現(xiàn)北京區(qū)域奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌是蠟樣芽孢桿菌[10]。因此,芽孢桿菌某些種有可能是潛在的致病菌從而引起子宮內(nèi)膜損傷及炎癥,是否存在北京地區(qū)特有的強(qiáng)致病力芽孢桿菌菌株,有待進(jìn)一步分離鑒定。

圖2 化膿隱秘桿菌毒力基因電泳凝膠結(jié)果

化膿隱秘桿菌能夠表達(dá)粘附宿主細(xì)胞的多種毒力基因,包括神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidases,nanH and nanP),膠原結(jié)合蛋白(Collagen-binding protein,cbpA),菌毛蛋白(Fimbriae expression,fimA,fimE,fimC,fimG)。據(jù)報(bào)道在產(chǎn)后1～3 d檢測(cè)到化膿隱秘桿菌的plo基因和fimA基因與子宮炎發(fā)生有一定關(guān)聯(lián),而產(chǎn)后8～10 d和34～36 d檢測(cè)到則與子宮內(nèi)膜炎發(fā)生相關(guān)[11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化膿隱秘桿菌在健康牛子宮中均可以分離得到,所有菌株均攜帶plo基因和fimA毒力基因。說明化膿隱秘桿菌存在且攜帶plo基因和fimA毒力基因,并不一定會(huì)導(dǎo)致奶牛子宮炎的發(fā)生。雖然本試驗(yàn)中奶牛個(gè)體數(shù)量較少無法明確反映群體發(fā)病規(guī)律,但該現(xiàn)象說明其他非化膿隱秘桿菌的致病因素參與奶牛子宮炎的發(fā)展過程。致病菌的存在是否會(huì)導(dǎo)致子宮感染及炎癥,與細(xì)菌的致病力和載量也有關(guān),但本試驗(yàn)并未進(jìn)行定量檢測(cè)和比較。

文獻(xiàn)中指出,化膿隱秘桿菌激活的子宮內(nèi)膜免疫應(yīng)答具有菌株特異性,分離患子宮內(nèi)膜炎和健康牛菌株攜帶不同的毒力基因,且前者引起子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞促炎因子(PTGS2,CXCL3,IL1A和IL6)表達(dá)水平更高[12]。本試驗(yàn)中認(rèn)為攜帶所有檢測(cè)的毒力基因的菌株具有潛在的強(qiáng)致病力,這樣的菌株在健康和患子宮炎奶牛中均有分離到,各菌株攜帶多種毒力基因的情況并不完全一致。這些分離株的致病力有待于通過感染子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。不同健康狀態(tài)的奶牛子宮內(nèi)環(huán)境是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌致病力差異有待進(jìn)一步研究,這為明確化膿隱秘桿菌致炎反應(yīng)菌株特異性的產(chǎn)生機(jī)制提供參考。

本研究結(jié)果表明,大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、芽孢桿菌是產(chǎn)后3周內(nèi)奶牛子宮分泌物中最常分離培養(yǎng)的細(xì)菌;從15頭健康奶牛和11頭患病奶牛的子宮分泌物中分離到17株化膿隱秘桿菌,所有菌株均攜帶plo基因和fimA基因;攜帶最多毒力基因的菌株在健康和子宮炎奶牛中均可以分離到。