馮肖肖,吳赟竑,吳雪軍,華炯鋼,張 存,張 璐,何 杰,徐 輝

(1.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心,浙江 杭州 311199;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,浙江 杭州 311199)

2013年2月開始我國上海、安徽、浙江等省市相繼出現(xiàn)了人感染H7N9流感的病例,并迅速傳播至其他省份,流行呈散發(fā)趨勢[1-5]。截止到2017年12月,我國已有人感染H7N9確診病例1 457例,死亡571例,死亡率為39.19%。H7N9亞型流感病毒屬于正粘病毒科甲型流感病毒屬,其基因組為8個節(jié)段的負鏈單股RNA病毒,在病毒增殖中極易發(fā)生變異[3-4]。2013年以來發(fā)現(xiàn)的H7N9流感病毒對禽類表現(xiàn)為低致病性,感染禽類后并無明顯臨床癥狀,并可以在禽類中持續(xù)擴散和傳播[4-5]。但是隨著病毒的變異和進化,2017年5月12日我國農(nóng)業(yè)部首次報道了一起家禽H7N9流感疫情,該新型H7N9流感病毒HA蛋白的裂解位點發(fā)生了變異,呈現(xiàn)典型的高致病性禽流感分子特征,對禽類表現(xiàn)為高致病性,臨床癥狀與H5亞型高致病性禽流感類似,死亡率較高,對家禽養(yǎng)殖和人類健康造成極大威脅[8-9]。截止到目前,我國河南、天津、陜西、內(nèi)蒙、黑龍江、安徽和河北等7個省份相繼發(fā)生了8起H7N9流感疫情,該疫情的快速傳播和流行已經(jīng)給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失,為防范家禽H7N9疫情風(fēng)險,保障公共衛(wèi)生安全,農(nóng)業(yè)部決定從2017年9月起全面實施H7N9免疫。

為了解和評估重組禽流感病毒H5+H7二價滅活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)(簡稱H5+H7二價苗)免疫禽群后抗體變化情況和免疫效果,本次試驗選擇了H7抗體陰性的雞場和鴨場各1個,按照農(nóng)業(yè)部高致病性禽流感免疫方案規(guī)定的免疫程序,開展了雞鴨現(xiàn)場免疫試驗,通過分析禽群免疫后的抗體效價和免疫合格率,評估H5+H7二價苗的免疫效果,從而為高致病性禽流感免疫方案制定提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料 14日齡雛雞和255日齡蛋雞由杭州余杭應(yīng)田和蛋雞場提供,主要品種為仙居雞;14日齡雛鴨和288日齡蛋鴨由紹興咸亨紹鴨育種有限公司提供,主要品種為紹興麻鴨。重組禽流感H5+H7二價滅活疫苗(H5N1 Re-8株和H7N9 Re-1株)由農(nóng)業(yè)部指定疫苗廠家哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn),生產(chǎn)日期為2017002,有效期為201806。禽流感H5(Re-8株)HI抗原(批號抗原2016008/陽性血清2016001),H7N9 H7-Re1株流感HI抗原(批號2016002/陽性血清2015002),均來自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋雞免疫抗體水平的測定 選取30只255日齡的蛋雞,按照農(nóng)業(yè)部高致病性禽流感免疫方案規(guī)定的免疫程序,首次免疫后4周加強免疫1次,免疫劑量均為0.5 mL/只,在免疫后0周(255日齡)、1周(262日齡)、2周(269日齡)、3周(276日齡)、4周(283日齡)、5周(290日齡)、6周(297日齡)、7周(304日齡)和8周(311日齡)各采血進行抗體檢測,記錄并計算產(chǎn)蛋量。

1.2.2 雛雞免疫抗體水平的測定 100只孵化至14日齡的雛雞隨機分為A、B兩組進行免疫,按照農(nóng)業(yè)部高致病性禽流感免疫方案規(guī)定的免疫程序,A組為“二次免疫組”,14日齡首次接種H5+H7二價滅活疫苗0.3 mL/只,35日齡二次免疫接種疫苗0.5 mL/只;B組為“一次免疫組”,只在14日齡接種1次疫苗0.3 mL/只。在免疫后0周(14日齡)、1周(21日齡)、2周(28日齡)、3周(35日齡)、4周(42日齡)、5周(49日齡)、8周(70日齡)和13周(105日齡)時分別隨機取30只采血進行抗體檢測。

1.2.3 蛋鴨免疫抗體水平的測定 選取30只288日齡的蛋鴨,按照農(nóng)業(yè)部高致病性禽流感免疫方案規(guī)定的免疫程序,首次免疫后4周加強免疫1次,免疫劑量均為1.0 mL/只,在免疫后0周(288日齡)、1周(295日齡)、2周(302日齡)、3周(309日齡)、4周(316日齡)、5周(323日齡)、6周(330日齡)、7周(337日齡)和8周(344日齡)分別采血進行抗體檢測,記錄并計算產(chǎn)蛋量。

1.2.4 雛鴨免疫抗體水平的測定 100只14日齡的雛鴨分為A、B兩組進行免疫,按照農(nóng)業(yè)部高致病性禽流感免疫方案規(guī)定的免疫程序,A組為“二次免疫組”,14日齡首次接種疫苗0.5 mL/只,35日齡二次免疫接種疫苗1.0 mL/只;B組為“1次免疫組”,只在14日齡接種一次疫苗0.5 mL/只。在免疫后0周(14日齡)、1周(21日齡)、2周(28日齡)、3周(35日齡)、4周(42日齡)、5周(49日齡)、8周(74日齡)和13周(100日齡)時分別隨機取30只采血進行抗體檢測。

1.2.5 抗體檢測 抗體檢測采用國家標準《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T 18936—2003)中血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗方法,檢測同一份血清樣品的禽流感H5N1 Re-8亞型、H7N9 H7-Re1亞型禽流感抗體滴度水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平 255日齡蛋雞首次接種重組禽流感H5+H7二價疫苗,劑量為0.5 mL/只,并于一免后4周進行2次免疫,接種劑量為1.0 mL/只。免疫結(jié)果如圖1所示,蛋雞在免疫前其體內(nèi)已有H5亞型抗體,平均效價達6.43 log2,免疫抗體合格率為100%。蛋雞H5亞型抗體水平在1免3周內(nèi)逐漸上升并達到峰值10.7 log2,隨后1周有所回落;二免后5周內(nèi)抗體水平始終維持在8.33～9.50 log2之間。同時,在蛋雞免疫周期內(nèi),H5亞型免疫抗體合格率始終為100%。

蛋雞在免疫前其體內(nèi)無H7亞型抗體,一免后H7亞型抗體水平迅速上升,一免后2周和4周抗體效價分別達到了6.10 log2和8.30 log2;二免后H7抗體水平繼續(xù)上升,至二免后2周達到峰值10.13 log2,隨后有所下降,至第8周抗體效價為8.33 log2。同時,H7亞型免疫抗體合格率在一免后2周迅速上升至100%,免疫后2周～8周始終保持在100%。

以上結(jié)果顯示,蛋雞在免疫接種重組禽流感H5+H7二價疫苗二次后,H5亞型抗體水平因母源抗體影響而緩慢上升,H7亞型抗體水平迅速上升,至免疫后期兩者抗體水平變化趨勢相近,抗體滴度都在8 log2以上。因此,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫蛋雞后可以快速達到穩(wěn)定良好的H5和H7亞型免疫抗體水平及100%的免疫抗體合格率,具有良好的免疫效果。

圖1 蛋雞免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

2.2 雛雞免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平

2.2.1 雛雞一次免疫后的抗體水平 雛雞只在14日齡進行一次免疫接種,劑量為0.3 mL/只。免疫結(jié)果如圖2所示,免疫前雛雞體內(nèi)的H5亞型母源抗體平均效價為2.53 log2,免疫抗體合格率為21.88%。免疫接種后1周母源抗體消失,H5亞型免疫抗體水平逐漸上升,第3周抗體水平即可達到5.37 log2,并在一免后4周達到峰值7.57 log2,隨后逐漸下降,第13周(105日齡)抗體平均效價為4.1 log2。同時,雛雞H5亞型免疫抗體合格率在免疫后3周達到合格(86.67%),第4周和第5周保持在100%,然后有所下降,至免疫后13周仍達到合格(80%)。

雛雞免疫前體內(nèi)無H7亞型抗體,免疫接種1周后母源抗體消失,H7亞型抗體水平迅速上升,第2周和第3周抗體平均效價分別可達到4.17 log2和6.37 log2,至免疫后4周達到峰值7.43 log2,隨后逐漸下降,第13周抗體平均效價為3.87 log2。雛雞H7亞型免疫抗體合格率在免疫后2周達到合格(73.33%),第3周至第5周都維持在100%,隨后下降,第13周仍合格為83%。

以上結(jié)果顯示,雛雞免疫接種一次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,第3周開始H5和H7亞型兩種免疫抗體合格率均在70%合格線以上波動,第4周達到最高水平,隨后逐漸下降,免疫8周以后抗體效價均低于6 log2。與蛋雞免疫后情況相似,免疫初期H7亞型抗體上升速率同樣快于H5亞型抗體,這可能是因為疫苗本身H7亞型抗原含量高于H5亞型引起的。這表明,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫雛雞一次后可以提供一定的免疫保護效果,但是不能產(chǎn)生較高的抗體水平,免疫效果欠佳。

2.2.2 雛雞二次免疫后的抗體水平 雛雞在14日齡和35日齡分別進行劑量為0.3 mL/只和0.5 mL/只的免疫接種。免疫結(jié)果如圖3所示,在首免后3周進行二次免疫后,H5和H7亞型免疫抗體水平均繼續(xù)保持上升趨勢,至第5周達到峰值,抗體平均效價分別為9.10 log2和9.70 log2,隨后逐漸下降,第13周(105日齡)H5和H7抗體平均效價分別為7.60 log2和7.10 log2。同時,H5和H7亞型免疫抗體合格率在二免后均持續(xù)保持在100%。

以上結(jié)果顯示,雛雞免疫接種兩次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,H5和H7亞型免疫抗體合格率分別在第4周和第3周達到100%,并隨后保持至第13周試驗結(jié)束。同時對比只免疫一次的雛雞組(圖4),雛雞二次免疫后各周H5和H7亞型抗體水平均進一步升高了2個滴度左右,并持續(xù)穩(wěn)定在7 log2以上,在免疫后5周以后兩者存在極顯著差異(P＜0.01)。這表明,雛雞在免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗兩次后,可以保證雛雞體內(nèi)存在穩(wěn)定持續(xù)的高抗體水平和100%的免疫抗體合格率,具有顯著的免疫保護效果。

圖3 雛雞二次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

圖4 雛雞免疫一次和兩次后免疫抗體水平差異比較

2.3 蛋鴨免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平 288日齡蛋鴨首次接種重組禽流感H5+H7二價疫苗后4周進行二次免疫,接種劑量均為1.0 mL/只。免疫結(jié)果如圖5所示,免疫前蛋鴨體內(nèi)H5亞型抗體平均效價為5.17 log2,免疫抗體合格率為86.67%。一免后H5亞型免疫抗體水平在2周迅速上升至9 log2以上,于第4周達到峰值9.73 log2;二免后H5抗體水平繼續(xù)維持在8.53～9.23 log2之間。同時,蛋鴨H5亞型免疫抗體合格率在免疫后2周即可達到100%,并持續(xù)維持至第8周。

免疫前蛋鴨體內(nèi)并無H7亞型抗體,免疫后H7抗體水平快速上升,一免后2周即可達到7.43 log2,隨后保持穩(wěn)定;二免后H7抗體水平進一步上升,于第6周達到峰值10.13 log2,隨后保持在9 log2左右的高水平。同樣的,蛋鴨H7亞型免疫抗體合格率在一免后2周迅速上升至100%并持續(xù)保持至第8周。

以上結(jié)果顯示,蛋鴨在免疫接種重組禽流感H5+H7二價疫苗后可以快速產(chǎn)生并持續(xù)保持高水平的H5和H7亞型免疫抗體和100%免疫抗體合格率,具有良好的免疫效果。

圖5 蛋鴨二次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

2.4 雛鴨免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平

2.4.1 雛鴨1次免疫后的抗體水平 雛鴨只在14日齡進行一次免疫接種,劑量為0.5 mL/只。免疫結(jié)果如圖6所示,免疫前雛鴨體內(nèi)的H5亞型母源抗體平均效價為0.83 log2,免疫抗體合格率為3.33%。免疫接種后1周母源抗體消失,H5亞型免疫抗體水平開始緩慢上升,并在免疫后4周達到峰值4.33 log2,隨后逐漸下降,至第13周(105日齡)抗體平均效價為1.77 log2。同時,雛鴨H5亞型免疫抗體合格率只有在免疫后4周才能達到70.00%,其余免疫周期內(nèi)均處于合格線以下。

圖6 雛鴨一次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

雛鴨免疫前體內(nèi)無H7亞型抗體,免疫接種后H7亞型免疫抗體水平迅速上升,第3周抗體效價達4.07 log2,并在一免后4周達到峰值5.63 log2,隨后迅速下降,第8周以后抗體效價下降為4 log2以下。H7亞型免疫抗體合格率在一免后4周才能達到合格(93.33%),隨后有所下降,第8周后下降為70%以下。

以上結(jié)果顯示,雛鴨免疫接種一次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,大部分免疫周期內(nèi)H5和H7亞型免疫抗體合格率均達不到70%的合格線,于第4周達到峰值后逐漸下降。盡管免疫初期H7亞型抗體上升速率和抗體效價均快于和高于H5亞型抗體,但免疫后各周抗體效價始終均低于6 log2。表明,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫雛鴨一次后H5和H7亞型免疫抗體水平和合格率整體不高,免疫效果不理想。

2.4.2 雛鴨2次免疫后的抗體水平 雛鴨在14日齡和35日齡分別進行劑量為0.5 mL/只和1.0 mL/只的免疫接種。免疫結(jié)果如圖7所示,二次免疫后1周H5和H7亞型免疫抗體水平均迅速上升至峰值,效價分別為8.13 log2和9.16 log2,隨后開始逐漸下降,至第13周(105日齡)H5和H7抗體平均效價分別為4.93 log2和5.03 log2。同時,H5和H7亞型免疫抗體合格率在二免后均持續(xù)保持在70%以上。

以上結(jié)果顯示,雛鴨免疫接種兩次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,H5和H7亞型免疫抗體合格率均在二免后保持70%以上。同時,比較雛鴨免疫一次和兩次后免疫抗體水平差異(圖8),雛鴨二次免疫后各周H5和H7亞型抗體水平均明顯比只一次免疫組的高3個滴度左右,二免后抗體平均效價均可維持在4.93 log2以上,在二免后1周以后兩者存在極顯著差異。表明,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫雛鴨兩次后,免疫效果明顯要好于一次免疫效果,但弱于于雛雞和蛋雞組免疫效果。

圖7 雛鴨二次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

圖8 雛鴨免疫一次和兩次后免疫抗體水平差異比較

2.5 重組禽流感H5+H7二價疫苗免疫后的產(chǎn)蛋影響 臨床觀察結(jié)果顯示(圖9),除雞群一免后兩天飲水量有所增加外,雞群免疫后的采食飲水、精神狀態(tài)、糞便等都保持正常;鴨群免疫后采食量有所下降,1周后恢復(fù)正常,其余精神狀態(tài)和糞便等并無明顯變化。蛋雞的產(chǎn)蛋量在免疫前后未見明顯變化,只是在免疫接種、采樣后會出現(xiàn)短暫下降,之后2～3 d即恢復(fù)到正常水平。蛋鴨產(chǎn)蛋率在免疫前后有比較明顯,免疫接種后下降幅度大可達16% ～30%,二免后產(chǎn)蛋率逐漸穩(wěn)定恢復(fù)正常水平。

圖9 蛋雞和蛋鴨免疫后產(chǎn)蛋率變化情況

3 討論

低致病性H7N9流感病毒一旦發(fā)生變異后對禽類表現(xiàn)為高致病性,2017年以來H7N9流感變異毒株給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的影響和損失[7-8]。國內(nèi)外禽流感防控實踐措施表明,疫苗免疫是防治禽流感的關(guān)鍵措施之一[6,10-11]。因此,家禽H7N9流感的全面免疫是目前高致病性禽流感防控的重要措施,切實有效的保障全國禽類養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全和公共衛(wèi)生安全。通過蛋禽2次免疫的現(xiàn)場免疫試驗(一免后4周二免)及雛禽的1次和2次免疫(一免后3周二免)的現(xiàn)場免疫試驗,結(jié)果分析表明：(1)重組禽流感H5+H7二價疫苗對蛋雞和蛋鴨都具有良好的免疫效果,免疫后2周H5和H7亞型免疫抗體水平均能達到100%的免疫合格率,并能持續(xù)保持至二免后4周;(2)重組禽流感H5+H7二價疫苗對雛雞也具有較好的免疫效果,免疫一次時H5N1 Re-8和H7N9 Re-1抗體水平分別在一免后3周和2周達到70%以上的免疫合格率,并維持到一免后13周;進行二次免疫后,H5N1 Re-8和H7N9 Re-1抗體滴度明顯高于一次免疫,并維持在較高的抗體水平。其中,H5 Re-8相對于H7N9 Re-1抗體效價產(chǎn)生較慢的原因可能與雛雞母源抗體的影響有關(guān);(3)重組禽流感H5+H7二價疫苗對雛鴨的免疫效果相對較差,H5N1 Re-8抗體水平在一次免疫周期內(nèi)處于70%合格率以下,一次免疫效果不理想;二免后1周H5和H7亞型抗體水平均能達到80%以上的合格率。同時,雛鴨抗體水平和合格率均要明顯低于雞群免疫效果。兩者免疫后在H5和H7抗體水平上能夠相差0.37～3.74 log2和1.14～2.30 log2個滴度,H5和H7抗體合格率在一免后最高可相差了53和40個百分點,二免后最高相差了20和10個百分點。因此,雛鴨必須進行二次免疫才能達到滿意的免疫效果;(4)重組禽流感H5+H7二價疫苗免疫后對蛋禽產(chǎn)蛋率有一定程度的影響。蛋雞產(chǎn)蛋率下降較少且很快恢復(fù)正常水平,蛋鴨產(chǎn)蛋率變化顯著,恢復(fù)時間也較長,表明蛋鴨比蛋雞更易受到應(yīng)激的影響。由于試驗需要蛋禽免疫后每周采集血樣測定抗體,免疫試驗中觀察到的蛋鴨產(chǎn)蛋影響時間較長與采血導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)極大相關(guān)。

因此,按照農(nóng)業(yè)部推薦的免疫程序,對生長期少于70日齡的雞一次免疫,生長周期70日齡以上的肉雞和蛋鴨首次免疫后3～4周進行二次免疫,免疫后H5和H7亞型免疫抗體效價均可達到較高水平并維持較長時間,能滿足本省高致病性禽流感防控要求。而對生長周期少于70日齡的肉鴨在一次免疫后3周需要進行加強免疫才能保證免疫效果,為減少風(fēng)險建議免疫2次以上。同時,在免疫接種蛋禽時要盡量減少接種應(yīng)激帶來的產(chǎn)蛋率下降的影響,可采取開產(chǎn)前強化免疫、疫苗回溫注射、添加適量多種維生素等措施。另外,重組禽流感H5+H7二價疫苗中抗原含量因不同生產(chǎn)廠家和各批次間的差異可能會有所不同,從而造成免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平差異。因此,免疫效果的持續(xù)監(jiān)測是當(dāng)前高致病性禽流感免疫防控工作中的重要環(huán)節(jié)。家禽免疫接種后及時進行抗體水平的免疫監(jiān)測和效果評價,對禽群中出現(xiàn)免疫副反應(yīng)、免疫抗體不達標、免疫失敗等情況要及時處理,進行補免或重免,以確保本省家禽高致病性禽流感的全面免疫效果。