高小博，姚楠，2，鄭盼盼，2，駱海燕，馬旭，陸彩玲，2*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100005)

顆粒細胞是卵泡的重要組成部分，圍繞在卵母細胞周圍為其提供營養(yǎng)并參與卵泡的發(fā)育。顆粒細胞也是女性性激素(主要包括甾體激素雌激素和孕酮)的主要來源，這些性激素調(diào)控了正常的月經(jīng)周期和生殖，因此顆粒細胞的增殖和分化是女性擁有正常生育功能的必要因素[1]。在卵泡刺激素(FSH)的刺激下，顆粒細胞增殖、分化以及具有了合成甾體激素的能力[2]。

miRNAs是一類長約22nt的非編碼的單鏈RNA分子，廣泛存在于線蟲、植物、動物及人類的細胞中。miRNA作為基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，主要以堿基配對的方式結(jié)合到靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，通過抑制或促進翻譯或降解mRNA的方式進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3-4]。miR-143是一個高度保守的miRNA，在血管損傷和重構(gòu)[5]、血液腫瘤發(fā)生和發(fā)展[6]、脂肪分泌及能量代謝[7]和調(diào)控神經(jīng)功能[8]等方面扮演重要角色。近年來，隨著對miRNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在顆粒細胞增殖和甾體激素分泌中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-143主要分布于小鼠卵巢的卵泡顆粒細胞中，隨著卵泡的發(fā)育miR-143在初級和次級卵泡中的表達水平較高[9]。Zhang等[10]證明在FSH介導的小鼠顆粒細胞中，miR-143沉默顯著促進顆粒細胞的增殖，并且miR-143抑制劑在翻譯和翻譯后水平上調(diào)3β-羥基固醇脫氫酶(3β-HSD)、芳香化酶(CYP19A1)、17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD1)等甾體激素合成相關(guān)基因的表達。然而，miR-143對FSH顆粒細胞孕酮生成的影響未見報道，本文進行了miR-143對FSH誘導顆粒細胞產(chǎn)生孕酮的作用研究。

材料和方法

一、實驗材料

反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)，RNA提取試劑Trizol(美國Thermo Fisher Scientific公司)，DMEM/F12液體培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，對照重組腺病毒Ad-miRNC和過表達miR-143的重組腺病毒Ad-miR143均購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司，miR-143 TaqMan MicroRNA Assays(美國Thermo Fisher Scientific公司)，碘[125I]孕酮放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)。CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，ABI Prism 7500實時定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，TC-512梯度PCR儀(英國Techne公司)，xh6080放免儀(西安核儀廠)。

二、研究方法

1.原代顆粒細胞培養(yǎng)：21日齡的雌性SD大鼠購自于維通利華公司，本研究所有實驗均按照《實驗動物護理與使用指南》的要求進行。每只SD大鼠腹腔注射20 U的孕馬血清(PMSG)飼養(yǎng)48 h后，頸椎脫臼處死并在無菌條件下取出雙側(cè)卵巢，剔除卵巢被膜及周圍組織，用1 ml注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞釋放出來，將顆粒細胞重懸于含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并以合適的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備后續(xù)處理。

2.顆粒細胞RNA提?。喝?5 mm培養(yǎng)皿中經(jīng)過不同處理的原代顆粒細胞，棄培養(yǎng)液后加入PBS洗2次，吸去PBS后加入RNA提取試劑Trizol，充分吹打至細胞完全裂解后，利用苯酚/氯仿抽提、異丙醇沉淀的方法提取RNA。

3.顆粒細胞miRNA實時定量RT-PCR檢測：miR-143實時定量RT-PCR檢測根據(jù)Applied Biosystems公司的TaqMan MicroRNA Assays試劑盒進行檢測，首先采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物進行逆轉(zhuǎn)錄，然后再采用miR-143特異性的TaqMan探針進行檢測。

4.病毒感染及FSH處理：原代顆粒細胞在含有15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，12 h后，DMEM/F12清洗細胞2～3次，洗去未貼壁的細胞，每個35 mm培養(yǎng)皿中加入1.5 ml含有10%FBS、無抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基，以3×1011粒子/ml的腺病毒感染顆粒細胞，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h，隨后將培養(yǎng)基換為無血清、無抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，加入含有50 ng/ml FSH的無酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基處理感染后的顆粒細胞。

5.放射免疫法測定孕酮：24孔板每孔中加入約5×105個顆粒細胞，用500 μl含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，然后進行相應處理。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞上清200 μl，儲存于-20℃，按照孕酮放射免疫分析試劑盒說明書測定孕酮的水平。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、FSH誘導原代顆粒細胞分泌孕酮模型的建立

分離大鼠原代顆粒細胞后用生理鹽水和50 ng/ml的FSH分別處理24 h，通過放射免疫測定技術(shù)(RIA)分析FSH刺激顆粒細胞后的孕酮水平，結(jié)果顯示FSH處理細胞后孕酮水平顯著增加(P<0.001)(圖1)。

注：與生理鹽水處理組比較，***P<0.001圖1 FSH誘導顆粒細胞分泌孕酮結(jié)果

二、FSH對原代顆粒細胞miR-143表達的影響

用50 ng/ml的FSH分別處理原代顆粒細胞0、6、12、24和48 h后，應用實時定量RT-PCR方法檢測miR-143的表達量，以U6 snRNA的表達水平為內(nèi)參，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-143在FSH處理顆粒細胞6、12 h后表達沒有顯著變化，在24 h后表達顯著增加(P<0.01)，在48 h時表達量最高(P<0.001)(圖2)。

注：與未經(jīng)FSH處理組比較，**P<0.01，***P<0.001圖2 FSH對原代顆粒細胞miR-143表達的影響

三、重組腺病毒過表達miR-143的鑒定

用對照重組腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分別感染原代顆粒細胞后，通過實時定量RT-PCR方法檢測細胞內(nèi)miR-143過表達水平，以U6 snRNA為內(nèi)參。結(jié)果顯示，與對照Ad-miRNC組相比，感染Ad-miR143組的細胞miR-143表達水平顯著增加(P<0.01)(圖3)。

注：與對照重組腺病毒Ad-miRNC組比較，**P<0.01圖3 重組腺病毒Ad-miR143感染細胞后的miR-143表達結(jié)果

四、過表達miR-143對顆粒細胞孕酮分泌水平的影響

用對照重組腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分別感染原代顆粒細胞后，加入50 ng/ml FSH再處理細胞24 h后，收集細胞上清檢測孕酮水平。結(jié)果表明，未經(jīng)FSH處理的各組之間孕酮分泌水平?jīng)]有顯著差異。經(jīng)FSH處理與未經(jīng)FSH處理比較，各組孕酮分泌水平顯著升高(P<0.001)，且感染Ad-miR143組與空白對照組和對照腺病毒組相比，孕酮分泌水平顯著升高(P<0.01)(圖4)。

注：與未經(jīng)FSH處理組比較，***P<0.001；與對照重組腺病毒Ad-miRNC組比較，##P<0.01圖4 miR-143過表達增加FSH刺激的顆粒細胞孕酮分泌

討 論

FSH受體(FSHR)是視紫紅素樣G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，特異性表達于卵巢顆粒細胞和睪丸支持細胞。FSHR以細胞內(nèi)側(cè)的C末端結(jié)束，該末端包含受體的重要功能模體[11]。FSH促進卵泡的募集，支持腔卵泡的生長、成熟和選擇，通過與顆粒細胞上FSHR結(jié)合激活一系列信號級聯(lián)引發(fā)優(yōu)勢卵泡排卵的生物學功能[12]。FSH與顆粒細胞上的FSHR結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶，提高細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，并激活蛋白激酶A(PKA)，然后PKA可以直接磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白質(zhì)包括Y盒結(jié)合蛋白1(YB-1)、組蛋白H3、cAMP響應原件結(jié)合蛋白(CREB)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等，也可以間接激活以轉(zhuǎn)錄和翻譯為主要調(diào)控目標的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)，進而促進顆粒細胞增殖和甾體激素的合成[13]。

哺乳動物卵泡形成是一個復雜的過程，F(xiàn)SH是卵泡在竇期以后正常發(fā)育的關(guān)鍵，是卵泡存活的主要因素，通過激活多種信號通路調(diào)節(jié)卵泡成熟所需的基因[14]。卵泡發(fā)育過程伴隨顆粒細胞增殖和分化以及甾體激素的分泌。我們課題組前期用FSH處理KK-1顆粒細胞系，利用Northern blot方法檢測發(fā)現(xiàn)10 ng/ml FSH抑制了miR-143、let-7a、miR-125b的表達，提示FSH在顆粒細胞中的作用受miRNA的調(diào)控[9]。在本研究中，我們利用50 ng/ml FSH處理原代顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)FSH處理24、48 h后上調(diào)miR-143的表達，這種差異可能與細胞類型和FSH處理劑量不同有關(guān)。張建芳等[15]利用原位雜交和實時定量PCR檢測小鼠卵巢，發(fā)現(xiàn)miR-143在顆粒細胞中的表達量約為卵母細胞中表達量的20倍，主要定位于各級卵泡的顆粒細胞。隨后他們證明從性交后15.5 d到產(chǎn)后4 d原始卵泡形成過程中，miR-143表達增加，原位雜交結(jié)果顯示miR-143定位于前顆粒細胞，并通過抑制前顆粒細胞增殖和下調(diào)細胞周期相關(guān)基因的表達來抑制原始卵泡的形成，表明miR-143對原始卵泡的形成至關(guān)重要[16]。這些研究提示miR-143通過調(diào)節(jié)顆粒細胞的增殖和功能參與卵泡的發(fā)育。Du等[17]發(fā)現(xiàn)FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通過靶向下調(diào)FSHR的表達，降低細胞內(nèi)PKA和AKT等信號分子水平，誘導豬顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖，研究進一步發(fā)現(xiàn)TGFβ信號分子SMAD4通過直接與miR-143的啟動子結(jié)合抑制miR-143的表達，從而正向調(diào)控FSHR的表達來參與顆粒細胞和卵泡發(fā)育調(diào)控。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)在小鼠卵巢中miR-143表達于初級、次級和竇性卵泡的顆粒細胞，并證明在FSH介導的小鼠顆粒細胞中miR-143沉默顯著增加雌二醇的產(chǎn)生和促進顆粒細胞的增殖，并且miR-143通過靶向調(diào)控KRAS實現(xiàn)對甾體激素合成相關(guān)基因的表達調(diào)控作用。Zhang等[18]證明在牛卵巢顆粒細胞中FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通過下調(diào)FSHR的表達減少孕酮的合成和雌二醇的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)miR-143過表達促進FSH介導的卵巢顆粒細胞孕酮的合成，提示FSH可能通過調(diào)控miR-143的表達調(diào)控顆粒細胞的功能。我們的結(jié)果進一步豐富了FSH對miRNA以及miRNA對顆粒細胞孕酮合成的調(diào)控。

綜上所述，本研究表明miR-143能夠促進FSH介導的卵巢顆粒細胞孕酮的分泌。我們將在上述研究的基礎(chǔ)上，探索miR-143調(diào)控孕酮生成的分子機制以及與FSH調(diào)控孕酮生成的其他已鑒定通路的關(guān)系，進一步揭示miR-143在卵巢顆粒細胞功能調(diào)控中的作用。