侯吉倫 郭亞男 付元帥 王桂興 張曉彥 孫朝徽 司 飛 王玉芬①

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站 秦皇島 066100; 2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

水產(chǎn)品是人類優(yōu)質(zhì)動物蛋白的重要來源。我國是世界上最大的水產(chǎn)動物養(yǎng)殖國，產(chǎn)量已連續(xù)多年位居世界首位。在多年的高速發(fā)展過程中，制約養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的不利因素逐漸顯現(xiàn)出來，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)量和效益造成嚴(yán)重影響。在眾多傳染性病害中，病毒性疾病所造成的影響尤為嚴(yán)重。隸屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)的淋巴囊腫病毒為重要病原之一，該病毒粒子正面觀為六角形的正二十面體構(gòu)造，因所依賴的宿主細(xì)胞不同，病毒粒子大小有差異，直徑介于130～350 nm之間，由核心體、中間脂質(zhì)層和衣殼三部分組成(Papernaet al,2001; Anders,1989)。目前，淋巴囊腫病毒呈世界性分布，造成9目42科125種以上魚類感染此病，其中，海水魚占30科(Wolf,1988)。病魚在身體軀干、口等部位可見不同形狀的囊腫物，雖致死率不高，但使患病魚失去商品價(jià)值 (侯吉倫等,2017)。

牙鲆(Paralichthys oliνaceus)為底棲冷水性魚類，具有生長迅速、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高、適宜集約化工廠養(yǎng)殖等特點(diǎn)，已成為我國北方的主要海水魚類增養(yǎng)殖品種之一(司飛等,2017)。1997年，我國養(yǎng)殖的牙鲆首次出現(xiàn)淋巴囊腫病，并逐漸成為危害牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。針對牙鲆淋巴囊腫病，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量的研究，并取得了相應(yīng)的研究進(jìn)展(Fujiet al,2006; Zhenget al,2010; Hwanget al,2011; Fanet al,2014; Wuet al,2015、2018)。為了在我國選育牙鲆抗淋巴囊腫新品種以及在分子層面解析抗病機(jī)理，作者在前期利用高通量測序技術(shù)對淋巴囊腫抗病和患病牙鲆頭腎組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，篩選獲得了包括efhd2和tbc1d25在內(nèi)的一批和抗病性緊密相關(guān)的功能基因。

EF-hand蛋白結(jié)構(gòu)域D2(EF-hand domain-containing protein D2,EFHD2)，又稱為 Swiprosin-1，是一個(gè)高度保守的鈣結(jié)合蛋白，屬于EF-hand結(jié)構(gòu)域家族，位于細(xì)胞膜脂肪微區(qū)域(Vuadenset al,2004)。EFHD2 在其C-端有1個(gè)保守的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用所必需的；在 N-末端，則具有獨(dú)特的多聚丙氨酸基序(大小為6～9個(gè)丙氨酸)。EFHD2廣泛表達(dá)于包括B細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞等各類細(xì)胞，在免疫調(diào)控起到重要的調(diào)控作用(Vega,2016)。EFHD2可通過調(diào)節(jié)適應(yīng)性和先天性免疫受體信號的關(guān)鍵因子Src激酶的活性而參與免疫細(xì)胞活化(Kroczeket al,2010)；調(diào)節(jié)未成熟 B細(xì)胞的壽命和 BCR信號閾值；同時(shí)，作為NF-kappa-B信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過bcl2l1豐度的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)自發(fā)性凋亡的調(diào)控(Avramidouet al,2007; Kimet al,2013)。

TBC1D25(TBC1 domain family member 25)，又稱為OATL1，屬于TBC家族，含有一段長約200個(gè)氨基酸的保守TBC(Rab-GAP)結(jié)構(gòu)域。TBC結(jié)構(gòu)域蛋白通過特異性識別Rab小GTP酶參與到細(xì)胞信號傳導(dǎo)、腫瘤形成及細(xì)胞內(nèi)其他的活動(Fukuda,2011)。TBC1D25被鑒定為一種新的Atg8同源結(jié)合蛋白，通過與 Atg8同系物直接相互作用被招募至自噬體(Itohet al,2011)。同時(shí)，作為 Rab33B(一種結(jié)合 Atg16L1的Rab蛋白)的GTP酶激活蛋白過表達(dá)促進(jìn)GTP酶RAB33B從GTP結(jié)合蛋白向GDP結(jié)合蛋白的平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬體和溶酶體之間的融合來延遲自噬體的成熟，從而實(shí)現(xiàn)抑制自噬的作用(Itohet al,2017; Coronaet al,2018)。

鑒于efhd2和tbc1d25在免疫調(diào)控中的重要作用，本研究首先利用 RACE 法(Rapid-amplification of cDNA ends)克隆了牙鲆efhd2和tbc1d25的cDNA全序列，并對序列特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)，通過熒光定量 PCR技術(shù)，研究了它們在牙鲆淋巴囊腫抗病和患病個(gè)體各組織、胚胎發(fā)育不同階段的表達(dá)特征，以期為闡明efhd2和tbc1d25在牙鲆抗淋巴囊腫病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牙鲆淋巴囊腫抗病和患病個(gè)體取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站昌黎養(yǎng)殖基地，體重為(235.65±73.18) g，全長為(30.49±3.17) cm。選取體表無淋巴囊腫瘤狀物的 3尾抗病牙鲆和有淋巴囊腫瘤狀物的3尾患病牙鲆(侯吉倫等,2017)，分別取全血、鰓、肝臟、頭腎、腸、性腺、肌肉、心臟和脾臟等置于液氮中速凍，48 h后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)所用牙鲆不同發(fā)育時(shí)期胚胎的按照劉海金等(2008)的方法進(jìn)行制備，受精卵在(16.0±0.5)℃的海水中孵化，采集受精卵(受精后 0 h，下同)、4 細(xì)胞(2 h)、32 細(xì)胞(4 h)、128 細(xì)胞(5 h)、高囊胚(6 h)、低囊胚(11 h)、原腸早期(15 h)、原腸晚期(27 h)、肌節(jié)期(32 h)、心跳期(55 h)和出膜仔魚(62 h)樣品，于液氮中速凍，48 h后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法對本研究所需各樣本的總RNA進(jìn)行提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總RNA質(zhì)量，微量紫外分光光度計(jì)(Pultton P100+)測定RNA濃度。經(jīng)檢測合格后的 RNA，用 cDNA試劑盒(Thermo K1621)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。

1.3 基因全長序列的克隆

根據(jù)牙鲆全基因組(Shaoet al,2017; Weiet al,2017)和 GenBank數(shù)據(jù)庫中登記的牙鲆efhd2(XM_ 020089176.1)和tbc1d25(XM_020089412.1)基因序列，利用 Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)引物(efhd2-F/efhd2-R，tbc1d25-F/tbc1d25-R，表1)，以頭腎cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證核心片段的準(zhǔn)確性。PCR反應(yīng)體系：上下游引物各 0.6 μl，模板 cDNA 1 μl，PCR Mix 7.5 μl，加 ddH2O 至 15 μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min；94℃ 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，為35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收純化，克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞，取3個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序。

在此基礎(chǔ)上，利用Primer Premier 6.0分別設(shè)計(jì)5'和 3'端的接頭引物和特異性引物(表1)，并采用RACE法，以牙鲆淋巴囊腫抗病個(gè)體頭腎RNA為模板，進(jìn)行降落PCR和巢式PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆、測序等步驟，獲得5'和3'端序列。利用SnapGene4.1軟件，對所獲得的5'和3'RACE序列以及中間片段進(jìn)行拼接，獲得efhd2和tbc1d25的cDNA全長序列。

1.4 基因的生物信息學(xué)分析

氨基酸序列用 ExPASy (http://www.expasy.ch/ tools/dna.html)進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)；信號肽使用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)進(jìn)行尋找；用 TMHMM server v.2.0 分析氨基酸跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/); 采用 ClustalX2對氨基酸序列進(jìn)行多重比對。使用MEGA10.0軟件的 Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap=1000)。

1.5 熒光定量 PCR

根據(jù)牙鲆efhd2、tbc1d25和β-actin(內(nèi)參基因)基因序列，分別設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參的引物(表1)，并以淋巴囊腫抗病和患病個(gè)體不同組織以及胚胎發(fā)育 不同時(shí)期的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。定量檢測采用 Power SYBR Green PCR Master Mix (ABI,美國)試劑盒在 ABI 7900 PCR 儀上開展?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量用 2-ΔΔCt法分析(馬慧鑫等,2018)。所有樣品均設(shè)置 3個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，并利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA) (P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆efhd2與tbc1d25基因序列分析

本研究克隆到的牙鲆efhd2基因cDNA全長5231 bp，其中，5'非翻譯區(qū)(Untranslated region,5'UTR)長度 142 bp，3'UTR 長度 4390 bp。ORF 長度699 bp，編碼 232 個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為26.4 kDa，等電點(diǎn)約為5.08。牙鲆efhd2基因所編碼的蛋白在第89～117以125～153位氨基酸具有2個(gè)典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域(圖1)。

表1 牙鲆efhd2和tbc1d25基因序列擴(kuò)增和定量PCR引物信息Tab.1 Primers information for cloning and Q-PCR of efhd2 and tbc1d25 in Paralichthys oliνaceus

tbc1d25基因全長為3173 bp，其中，5'UTR長度為 108 bp，3'UTR長度為464 bp。ORF長度為2601 bp，編碼866個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為96.4 kDa，等電點(diǎn)約為5.47。TBC1D25蛋白在199～431位氨基酸為典型的TBC結(jié)構(gòu)域(圖2)。

SignalP分析未發(fā)現(xiàn)EFHD2和TBC1D25蛋白具有信號肽。TMHMM分析顯示，這 2個(gè)蛋白均無跨膜區(qū)。采用 ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/)的GOR4工具預(yù)測EFHD2與TBC1D25蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。EFHD2 蛋白的 α-螺旋(Alpha helix,Hh)包含 150個(gè)氨基酸殘基，占氨基酸殘基總量的 64.38%；延伸鏈(Extended strand,Ee)包含 10個(gè)氨基酸殘基，占氨基酸殘基總量的4.29%；無規(guī)卷曲(Random coil,Cc)包含73個(gè)氨基酸殘基，占氨基酸殘基總量的31.33%。在TBC1D25蛋白中，α-螺旋包含274個(gè)氨基酸殘基，占氨基酸殘基總量的31.60%；延伸鏈包含 109個(gè)氨

基酸殘基，占氨基酸殘基總量的 12.57%；無規(guī)卷曲包含484個(gè)氨基酸殘基，占氨基酸殘基總量的55.82%。較之于EFHD2蛋白，TBC1D25蛋白α-螺旋含量比例少，而延伸鏈和無規(guī)卷曲的含量比例較高。

圖1 牙鲆efhd2基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of P.oliνaceus efhd2

圖2 牙鲆tbc1d25基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of P.oliνaceus tbc1d25

2.2 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將 EFHD2蛋白分別與斑馬魚(Danio rerio)(NP_ 001313422.1)、青鳉(Oryzias latipes)(XP_023812778.1)、小鼠(Mus musculus)(NP_080270.2)和人(Homo sapiens) (NP_077305.2)的同源序列蛋白進(jìn)行比較，序列一致性分別為83%、88%、73%和72%(圖3)。利用NJ法對牙鲆EFHD2蛋白與其他8個(gè)物種的EFHD2蛋白氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果顯示，牙鲆EFHD2 與半滑舌鰨(Cynoglossus semilaeνis)聚為一小支，隨后與青鳉、大西洋鮭(Salmo salar)、鯽魚(Carassius auratus)和斑馬魚聚為一大支，而小鼠、人和牛(Bos taurus)等哺乳動物則聚為另一支(圖4)。

TBC1D25蛋白斑馬魚(NP_001121708.10)、青鳉(XP_011471287.2)、小鼠(NP_001159909.1)和人(NP_ 001335191.1)的同源序列一致性分別為 71%、74%、72%和74%(圖5)。進(jìn)化樹結(jié)果表明，牛、小鼠和人等哺乳動物聚為另一支，6種魚類聚為另一支，牙鲆在魚類所構(gòu)成的一支中，先與半滑舌鰨聚為一支，再與青鳉、大西洋鮭、鯽魚和斑馬魚聚為一大支(圖6)。

圖3 牙鲆EFHD2氨基酸多重序列比對結(jié)果Fig.3 The multiple sequence alignment of the EFHD2 amino acid

圖4 牙鲆EFHD2與其他物種EFHD2系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of P.oliνaceus EFHD2 amino acid sequence with EFHD2 sequences of other species

圖6 牙鲆TBC1D25與其他物種TBC1D25系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of P.oliνaceus TBC1D25 amino acid sequence with TBC1D25 sequences of other species

2.3 牙鲆efhd2與tbc1d25基因在胚胎發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR檢測了牙鲆受精卵、4細(xì)胞、32細(xì)胞、128細(xì)胞、高囊胚、低囊胚、原腸早期、原腸晚期、肌節(jié)期、心跳期和出膜仔魚中efhd2與tbc1d25mRNA的表達(dá)情況，并以原腸早期為基準(zhǔn)進(jìn)行相對表達(dá)量的計(jì)算。結(jié)果顯示，efhd2基因在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有不同程度的表達(dá)(圖7)，但在 4細(xì)胞、低囊胚和原腸早期的表達(dá)量相對較低，與其他時(shí)期差異顯著(P＜0.05)；從肌節(jié)期開始，efhd2的表達(dá)量開始呈上升趨勢，且在出膜仔魚中的表達(dá)量，顯著高于其他各組(P＜0.05)。

圖7 牙鲆efhd2基因在胚胎發(fā)育不同時(shí)期的相對表達(dá)Fig.7 The relative expression level of P.oliνaceus efhd2 in different embryo development stage

tbc1d25基因在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期也均有不同程度的表達(dá)(圖8)。其中，受精卵中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(P＜0.05)；隨著發(fā)育的進(jìn)行，tbc1d25基因的表達(dá)量在原腸晚期降至最低(P＜0.05)；在之后的發(fā)育時(shí)期中，原腸晚期、肌節(jié)期和心跳期的表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)；出膜仔魚中tbc1d25的表達(dá)量又有一定的上升，顯著高于除受精卵和32細(xì)胞之外的其他時(shí)期(P＜0.05)。

圖8 牙鲆tbc1d25基因在胚胎發(fā)育不同時(shí)期的相對表達(dá)Fig.8 The relative expression level of P.oliνaceus tbc1d25 in different embryo development stage

2.4 牙鲆efhd2與tbc1d25基因在淋巴囊腫抗病和患病個(gè)體中的差異表達(dá)

以患病組性腺為基準(zhǔn)進(jìn)行efhd2和tbc1d25基因相對表達(dá)量的計(jì)算。efhd2基因在所檢測的淋巴囊腫抗病和患病個(gè)體的頭腎、肝臟、血液、鰓、心臟、性腺、肌肉、腸和脾臟等組織中均有表達(dá)(圖9)。其中，在抗病魚的血液、鰓、性腺、肌肉和脾臟的相對表達(dá)量要高于患病魚，特別是在血液中，抗病魚efhd2基因的表達(dá)量高于患病魚，差異顯著(P＜0.05)。

與efhd2基因相似，tbc1d25基因在所檢測的各個(gè)組織中也均有表達(dá)(圖10)。其中，在抗病魚的肝臟、血液、性腺的相對表達(dá)量要高于患病魚，特別是在血液中的表達(dá)量，二者差異極顯著(P＜0.01)。

圖9 牙鲆efhd2基因在淋巴囊腫抗病和患病 個(gè)體不同組織的相對表達(dá)Fig.9 The relative expression level of P.oliνaceus efhd2 in different tissues of lymphocystis disease resistant and sensitive individuals

圖10 牙鲆tbc1d25基因在淋巴囊腫抗病和 患病個(gè)體不同組織的相對表達(dá)Fig.10 The relative expression level of P.oliνaceus tbc1d25 in different tissues of lymphocystis disease resistant and sensitive individuals

3 討論

本研究克隆獲得了牙鲆efhd2和tbc1d25基因的cDNA全序列，序列分析表明，上述2個(gè)基因都含有各自家族典型的結(jié)構(gòu)域。同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，在魚類中，2個(gè)基因與其他魚種具有較高的同源性，在進(jìn)化上表現(xiàn)出一定的保守性。目前，關(guān)于efhd2和tbc1d25基因功能的研究，開展的較少，在魚類上尚未見報(bào)道。

本文首次對efhd2和tbc1d25基因在牙鲆胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，2個(gè)基因均有不同程度的表達(dá)。efhd2基因在受精卵中有一定量的表達(dá)，表明其可能為母源效應(yīng)基因。其表達(dá)量在經(jīng)過卵裂期到原腸晚期的低水平表達(dá)后，從肌節(jié)期開始，又顯著上升。efhd2是高度保守的鈣結(jié)合蛋白，在神經(jīng)和免疫細(xì)胞的Ca2+信號傳導(dǎo)中起重要作用(Brachset al,2013)。在牙鲆的胚胎發(fā)育中，自原腸后期開始，神經(jīng)胚開始逐漸形成，神經(jīng)細(xì)胞被大量生成，efhd2基因在原腸后期開始所出現(xiàn)的表達(dá)水平提高，可能與之有關(guān)。

在所研究的胚胎發(fā)育各時(shí)期中，tbc1d25基因在受精卵的表達(dá)量最高，表明其也是母源效應(yīng)基因。tbc1d25所屬的TBC基因家族是真核細(xì)胞保守的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)的各種步驟，包括囊泡形成、沿細(xì)胞骨架的囊泡運(yùn)輸、運(yùn)輸囊泡與靶膜的錨定/對接、以及運(yùn)輸囊泡與靶膜的膜融合等(Pereira-Lealet al,2001; Grosshanset al,2006; Schwartzet al,2007; Fukuda,2008; Stenmark,2009; Frasa,2012)。而在胚胎發(fā)育的各階段，都離不開膜轉(zhuǎn)運(yùn)的參與，因此，tbc1d25在此過程中可能起到一定的作用。

本研究中，牙鲆淋巴囊腫抗病個(gè)體血液中efhd2和tbc1d25基因的表達(dá)量都顯著高于患病個(gè)體。魚類免疫相關(guān)基因在血液中高表達(dá)的現(xiàn)象，在以往的研究中也有所報(bào)道。例如，在羅非魚的11個(gè)組織中，血液里TRIM16和TRIM25的表達(dá)量最高(鄭建美等,2017)。血液是機(jī)體內(nèi)不同器官間物質(zhì)的傳輸介質(zhì)。在牙鲆淋巴囊腫患病個(gè)體的心臟、頭腎、脾臟和腸等內(nèi)臟器官中均可檢測到淋巴囊腫病毒顆粒(曲凌云等,2000)。Kinne(1984)認(rèn)為，鰓可能是淋巴囊腫病毒感染牙鲆的一個(gè)門戶。病毒進(jìn)入鰓之后，就需要通過連接各內(nèi)臟器官的液體介質(zhì)——血液進(jìn)行傳播。除了作為傳輸介質(zhì)，血液也是重要的免疫器官，是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等各類免疫細(xì)胞的天然攜帶者，可在體內(nèi)免疫應(yīng)答過程中執(zhí)行關(guān)鍵的生理和生化功能。隨著血液流經(jīng)整個(gè)機(jī)體，會將大量的免疫細(xì)胞從一個(gè)器官轉(zhuǎn)移到另一個(gè)器官，從而充當(dāng)免疫系統(tǒng)管道的角色，在魚類疾病防治中發(fā)揮著重要的作用(Dalmoet al,1997; Castilloet al,1998)。就淋巴囊腫病毒感染而言，當(dāng)病毒顆粒通過血液在不同器官間傳輸時(shí)，可能會激活血液中相關(guān)免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致包括efhd2和tbc1d25等在內(nèi)的一系列基因的高表達(dá)。但有趣的是，efhd2的功能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而tbc1d25的潛在作用則是抑制自噬。細(xì)胞凋亡和自噬之間存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，彼此之間既可相互促進(jìn)(Gorskiet al,2003)，也可互為拮抗(Younget al,2006; Zenget al,2012; Hassanet al,2015; Chenet al,2016)。就本研究而言，淋巴囊腫病毒感染牙鲆后，抗病個(gè)體血液中的細(xì)胞凋亡和自噬互為拮抗關(guān)系。通過較高水平的細(xì)胞凋亡，達(dá)到對因病毒感染所損傷血液細(xì)胞的消除，從而恢復(fù)血液組成的動態(tài)平衡，這可能對維持病毒感染后魚體的正常生理水平和實(shí)現(xiàn)魚體的抗病功能具有重要的作用。

作為重要的免疫器官，頭腎和脾的免疫功能已被廣泛研究(Yanget al,2016; 張文婷等,2016; 鄭建美等,2017)。免疫功能基因在頭腎和脾的表達(dá)量，受多種因素所影響，并不一定高于其他組織。在半滑舌鰨中，TLR5S基因在肝臟中的表達(dá)量最高，而在脾的表達(dá)量最低(張文婷等,2016)。在本研究中，淋巴囊腫抗病和患病個(gè)體頭腎和脾efhd2和tbc1d25基因的表達(dá)量差異不顯著，其可能原因?yàn)閑fhd2和tbc1d25基因在淋巴囊腫病毒進(jìn)入魚體經(jīng)血液向其他組織擴(kuò)散的階段起到免疫作用，但具體原因有待于深入研究。

綜上所述，本研究報(bào)道了牙鲆efhd2和tbc1d25基因的分子特征，分析了它們不同胚胎發(fā)育過程以及淋巴囊腫抗病和患病不同組織的表達(dá)情況特征，為進(jìn)一步研究二者的功能和牙鲆淋巴囊腫抗病機(jī)理奠定了一定的理論基礎(chǔ)。