鄒培卓 楊 倩 董 宣 謝國駟 黃 倢①

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與 技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

細(xì)菌計(jì)數(shù)方法是微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，主要分為直接計(jì)數(shù)法和間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。直接計(jì)數(shù)法主要有顯微鏡觀察法(包括光學(xué)顯微鏡技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)等)和比濁計(jì)數(shù)法等；間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法主要有平板菌落計(jì)數(shù)法(包括傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法、微菌落技術(shù)等)和最大或然數(shù)計(jì)數(shù)法(Most probable number，MPN法，也稱為稀釋培養(yǎng)法)等(王婷婷等,2008)。傳統(tǒng)的直接計(jì)數(shù)法不能區(qū)分細(xì)菌的死活，且靈敏度低、線性范圍狹窄，間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法雖然能確定活菌數(shù)量，但工作量大，難以對(duì)大批量樣品進(jìn)行同時(shí)操作。例如，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中的菌群計(jì)數(shù)法采用MPN法和平板計(jì)數(shù)法(GB 4789.3-2010)，這2種方法都需要培養(yǎng)24～48 h，且工作量大、檢測(cè)線性范圍窄，難以進(jìn)行快速、大批量的檢測(cè)工作，MPN法的精確性還存在疑問；為了簡化檢測(cè)程序、縮短檢測(cè)時(shí)間，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的快速檢測(cè)方法的研究，提出了電阻抗檢測(cè)法、Sim PlateTM全平皿計(jì)數(shù)法、微菌落技術(shù)、最大或然數(shù)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)計(jì)數(shù)法(MPN-PCR法)、流式細(xì)胞儀測(cè)定法等檢測(cè)方法，取得了一定的成果，但也存在不同的缺陷和不足。例如，流式細(xì)胞儀測(cè)定法雖然靈敏度、簡便性都有了較大的提升，但由于其成本昂貴，且不能區(qū)分細(xì)菌的死活，在實(shí)際應(yīng)用中受到了很大的制約。

MTT是 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，能穿過細(xì)胞膜被活細(xì)胞線粒體中的琥鉑酸脫氫酶還原，形成藍(lán)紫色不溶于水的甲瓚(Formazan) (Mosmann,1983)，死細(xì)胞酶活性喪失而沒有顏色反應(yīng)。用有機(jī)溶劑溶解甲瓚后(邊興艷,1998)，測(cè)定溶液的吸光度(OD 值)而確定活細(xì)胞數(shù)(Gerlieret al,1986)。該法快速、經(jīng)濟(jì)、操作相對(duì)簡便、重復(fù)性較好，近年來被廣泛應(yīng)用到大腸桿菌(Escherichia coli) (王栩等,2002)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) (黃立坤等,2008)、伴放線菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans) (王忠朝等,2010)和酵母菌 (龔加路等,2016)等的活菌計(jì)數(shù)中。

三磷酸腺苷(ATP)是所有生命活動(dòng)的能量載體(Veltenet al,2007)，活細(xì)菌中 ATP 含量會(huì)維持在一定范圍，細(xì)菌死亡后 ATP會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被細(xì)胞內(nèi)酶所分解(Holm-Hansenet al,1966)，樣品中 ATP 含量即可間接反映活細(xì)菌數(shù)量。ATP生物發(fā)光法(Milleret al,1992; Selanet al,1992; Nyrén,1994; McElroyet al,1949)是熒光素酶在Mg2+條件下催化熒光素與ATP反應(yīng)形成熒光素-AMP的復(fù)合物，與O2結(jié)合時(shí)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度呈線性關(guān)系，從而檢測(cè)活菌的數(shù)量(Moyeret al,1983; Gr?nrooset al,1983)。ATP 生物發(fā)光法操作簡便，能快速得到結(jié)果，與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法相比，不僅能區(qū)分細(xì)菌的死活，而且還能檢測(cè)出不可培養(yǎng)的微生物(Hammeset al,2010)。

借鑒實(shí)時(shí)定量 PCR的擴(kuò)增曲線原理，利用微生物類似于PCR擴(kuò)增的指數(shù)生長曲線(Brewster,2003)，建立了高通量生長曲線法，該法與傳統(tǒng)的MPN法完全不同，是根據(jù)細(xì)菌生長達(dá)到特定濁度的時(shí)間進(jìn)行活菌的計(jì)數(shù)，在微孔板的微量培養(yǎng)體積上，設(shè)置多個(gè)平行，以高通量的方式對(duì)微生物的生長進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，達(dá)到類似實(shí)時(shí)定量 PCR那樣在極寬的線性范圍進(jìn)行微生物的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的效果。在上述背景下，本研究對(duì)MTT比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長曲線法進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌

實(shí)驗(yàn)用副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的編號(hào)為 20130629002S01(以下簡稱 2S01)，取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)研究室(王娜等,2016; Donget al,2017)。將凍存的2S01菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)平板上劃線，28℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中，于28℃以110 r/min過夜振蕩培養(yǎng)，3000 r/min離心10 min，并用磷酸緩沖溶液(PBS)清洗沉淀、重懸，調(diào)整其OD600 nm=0.5，經(jīng)平板計(jì)數(shù)方法檢測(cè)其濃度約為1.12×108CFU/ml。取 2 ml接種于 200 ml TSB 培養(yǎng)基中，在 28℃以110 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)4～6 h，待細(xì)菌剛達(dá)到指數(shù)生長期時(shí)，用冷凍離心機(jī)4℃離心3次，并用PBS溶液清洗沉淀、重懸，調(diào)整其OD600 nm=0.5，備用。

1.2 MTT比色法

1.2.1 檢測(cè)波長確定 將 100 μl重懸菌液加入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning,美國)，然后每孔加入 20 μl 5 mg/ml的 MTT 溶液(溶于 PBS 溶液并經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌)(Solarbio)，用微孔板振蕩儀混勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h，取出后于4000 r/min離心10 min，吸出上清液，每孔加入 150 μl DMSO (Solarbio,中國)，振蕩混勻10 min，設(shè)定 Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(Thermo,美國)波長在400～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，只加DMSO作為空白對(duì)照組，每組3個(gè)平行。

1.2.2 MTT溶液的使用劑量 在相同量的菌液中分別加入終濃度為 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/ml的 MTT 溶液，充分反應(yīng)后離心，棄上清液，每組3個(gè)平行，按MTT比色法的步驟測(cè)量各組OD值。

1.2.3 干擾物質(zhì)的影響 以DMSO為參比，以PBS溶液和121℃滅菌20 min的死亡菌體為樣品，用MTT法測(cè)量，每組3個(gè)平行。

1.2.4 MTT溶液與菌液反應(yīng)時(shí)間 分別將MTT法的 37℃孵育反應(yīng)經(jīng) 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后，離心棄上清液，終止反應(yīng)，每組3個(gè)平行，按上述方法測(cè)量各組OD值。

1.2.5 檢測(cè)范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線 將濃度為1×109CFU/ml的菌懸液按 2倍濃度梯度依次稀釋為9.77×105～1×109CFU/ml，每組 3 個(gè)平行，用 MTT 法測(cè)量各組OD值，用SigmaPlot 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Polynomial進(jìn)行線性分析，建立菌液濃度與其反應(yīng)后OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 ATP生物發(fā)光法

1.3.1 試劑盒可靠性檢測(cè) 按增強(qiáng)型 ATP檢測(cè)試劑盒(Beyotime)說明書操作步驟用試劑盒提供的ATP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試劑盒驗(yàn)證，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 檢測(cè)范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線 將調(diào)整 OD 后的菌液稀釋成濃度為 3×103、1×104、3×104、1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109CFU/ml的菌懸液，然后按照試劑盒說明書測(cè)量各組相對(duì)發(fā)光度值(RLU)，每組3個(gè)平行，建立菌液濃度與其反應(yīng)后RLU的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 高通量生長曲線法

1.4.1 不同濃度菌液連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行OD值測(cè)定 將調(diào)整 OD 后的菌液稀釋成 1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109CFU/ml 的菌懸液，每個(gè)梯度取2 μl，用8通道移液器加至預(yù)先加有 198 μl TSB培養(yǎng)基的96孔板中，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，設(shè)置PBS空白對(duì)照，用渦旋振蕩儀混勻，放入 28℃恒溫培養(yǎng)箱，300 r/min振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 h 測(cè)定 OD600 nm。

1.4.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 將細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間和 OD600 nm的讀數(shù)扣除未接種細(xì)菌的培養(yǎng)基孔的OD600 nm值，用SigmaPlot 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，按Sigmoid曲線類型用3參數(shù)模式擬合，根據(jù)擬合出的方程，統(tǒng)計(jì)其各組菌液生長曲線達(dá)到a/2值的時(shí)間x0，建立菌液濃度與該時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 副溶血弧菌菌液的測(cè)量

取 10份不同濃度的副溶血弧菌菌液，分別用 3種計(jì)數(shù)方法與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行對(duì)比，分析3種計(jì)數(shù)方法的計(jì)數(shù)結(jié)果(C)與平板計(jì)數(shù)法的計(jì)數(shù)結(jié)果(CP)的線性關(guān)系和變異系數(shù)(C.V.)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT比色法

2.1.1 檢測(cè)波長 MTT經(jīng)細(xì)菌產(chǎn)物呈藍(lán)紫顏色，將培養(yǎng)的副溶血弧菌懸液進(jìn)行波長掃描(圖1)，結(jié)果顯示，藍(lán)紫色產(chǎn)物的最大吸收峰值在550～560 nm之間。DMSO的吸光度對(duì)實(shí)驗(yàn)組吸光度影響很小，且沒有峰值出現(xiàn)，屬于背景吸收，因此，將MTT法的檢測(cè)波長定為555 nm。

圖1 MTT產(chǎn)物甲瓚的光吸收檢測(cè)波長掃描Fig.1 The scanning of photoabsorption detection wavelength of formazan produced by MTT

2.1.2 MTT溶液的使用劑量 設(shè)定不同的MTT用量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(圖2)，當(dāng)細(xì)菌反應(yīng)液中MTT濃度為0.2 mg/ml，產(chǎn)生甲瓚沉淀的量最多，甲瓚的吸收曲線呈現(xiàn)峰值，因此，將 MTT終濃度定為0.2 mg/ml。MTT 量超過 0.2 mg/ml時(shí)，產(chǎn)生的甲瓚量會(huì)逐漸減少。

圖2 MTT濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.2 Effects of the MTT concentration on the measuring results

2.1.3 干擾物的影響 以 DMSO為參照，用 PBS或滅活菌體作為樣品進(jìn)行MTT反應(yīng)檢測(cè)，所得的檢測(cè)值很低(表1)，經(jīng)t檢驗(yàn)，得出 3組數(shù)據(jù)兩兩間均無顯著差異(P＞0.05)，因此，可以忽略這些干擾物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間的影響 細(xì)菌與MTT的反應(yīng)時(shí)間在0.5～2 h時(shí)，形成甲瓚的量在逐漸增多，2 h后維持在相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)量(圖3)，因此，將反應(yīng)時(shí)間定為2 h。

表1 不同干擾物以DMSO為對(duì)照時(shí)的OD值Tab.1 OD value of the different interfering substances compared with DMSO

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.3 Effects of reaction time on the measuring results

2.1.5 檢測(cè)范圍 通過選擇上述參數(shù)，用優(yōu)化的MTT法在微孔板中進(jìn)行副溶血弧菌的高通量活菌計(jì)數(shù)，用SigmaPlot的Polynomial線性分析，當(dāng)菌液濃度為7.81×106～2.50×108CFU/ml時(shí)，其對(duì)應(yīng)的OD555 nm值與活菌數(shù)的線性關(guān)系極顯著，線性范圍跨度約為 2個(gè)細(xì)菌濃度數(shù)量級(jí)，其關(guān)系式為 LgC=(1.0439± 0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125)，R2=0.9965 (圖4)。

圖4 菌液濃度對(duì)數(shù)LgC與OD值對(duì)數(shù) LgOD555 nm 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve between the logarithmic concentration of bacteria (LgC) and logarithmic OD555 nm value (LgOD555 nm)

2.2 ATP生物發(fā)光法

2.2.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線 用增強(qiáng)型 ATP檢測(cè)試劑盒對(duì) ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在 1.0×10-1～1.0×104nmol/L 時(shí)，ATP 濃度的對(duì)數(shù)(LgATP)與發(fā)光強(qiáng)度對(duì)數(shù)(LgRLU)的線性關(guān)系極顯著，其關(guān)系式為 LgATP=1.0509LgRLU-4.3223，R2=0.9974(圖5)，表明該試劑盒在該范圍內(nèi)的測(cè)定結(jié)果可靠。

圖5 ATP濃度對(duì)數(shù)(LgATP)與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU) 對(duì)數(shù)(LgRLU)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve between the logarithmic concentration of ATP (LgATP) and logarithmic relative intensity of luminescence(LgRLU)

2.2.2 菌液濃度對(duì)數(shù) LgC與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)數(shù)LgRLU的標(biāo)準(zhǔn)曲線 用增強(qiáng)型 ATP試劑盒對(duì)已知濃度的副溶血弧菌樣品進(jìn)行檢測(cè)，用 SigmaPlot的Polynomial 線性分析，當(dāng)菌液濃度在 1.0×104～3.0× 108CFU/ml時(shí)，其對(duì)應(yīng)的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)數(shù)(LgRLU)與活菌數(shù)對(duì)數(shù)(LgC)的線性關(guān)系極顯著，線性范圍跨度約為 4.5個(gè)細(xì)菌濃度數(shù)量級(jí)，其關(guān)系式為 LgC= (0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366)，R2=0.9994 (圖6)。

2.3 高通量生長曲線法

將濃度為 1.0×100～1.0×107CFU/ml的副溶血弧菌加到預(yù)先加有培養(yǎng)基的多孔板中，每隔 1 h，測(cè)定OD600 nm值，扣除未接種細(xì)菌孔的OD600 nm后，得出各初始濃度的細(xì)菌吸光度所代表的生長變化，可看到這些生長變化都呈S形(Sigmoid)曲線分布，不同濃度的S曲線在拐點(diǎn)處的生長速率基本接近，經(jīng)SigmaPlot的Sigmoid曲線類型3參數(shù)模式擬合，得到各初始濃度的細(xì)菌生長曲線(圖7)。用SigmaPlot的Polynomial線性分析，取各濃度擬合曲線的拐點(diǎn)時(shí)間參數(shù)(Ts)，即為生長達(dá)到最大值的50%的生長時(shí)間，該時(shí)間在所測(cè)定的初始細(xì)菌濃度范圍內(nèi)均與活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值(LgC)具有極顯著的線性關(guān)系，線性關(guān)系跨度達(dá) 7個(gè)數(shù)量級(jí)，其關(guān)系式為 LgC= -(0.8727±0.0230)Ts+ (9.0128±0.1572)，R2=0.9924(圖8)。

圖6 菌液濃度對(duì)數(shù)LgC與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度 對(duì)數(shù)LgRLU的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve between the logarithmic concentration of bacteria (LgC) and logarithmic intensity of luminescence(LgRLU)

圖7 各初始濃度菌液的生長曲線Fig.7 Growth curve of each initial concentration of bacteria

圖8 菌液濃度LgC與生長曲線的 拐點(diǎn)時(shí)間(Ts)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve between the concentration of bacteria (LgC) and the spinodal time (Ts) of growth curves

2.4 副溶血弧菌菌液檢測(cè)

分別采用MTT比色法、ATP發(fā)光法和高通量生長曲線法對(duì)10份不同濃度的副溶血弧菌菌液進(jìn)行檢測(cè)，并與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較(圖9)。結(jié)果顯示，MTT法計(jì)數(shù)的 9個(gè)在線性范圍內(nèi)的樣品計(jì)數(shù)值的對(duì)數(shù)(LgCMTT)與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果的對(duì)數(shù)(LgCP)之間具有極顯著的線性關(guān)系(R2=0.9620，P=3.42×10-7)，其關(guān)系式為 LgCMTT/LgCP=1.0123(圖9)。9個(gè)樣品的變異系數(shù)為(18.50±12.03)%，超出檢測(cè)線性范圍的1個(gè)樣品的濃度為 4.82×106CFU/ml，其變異系數(shù)為 36.61%。ATP發(fā)光法計(jì)數(shù)的 9個(gè)在線性范圍內(nèi)的樣品計(jì)數(shù)值的對(duì)數(shù)(LgCATP)與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果的對(duì)數(shù)(LgCP)之間具有極顯著的線性關(guān)系(R2=0.9981,P=1.72×10-11)，其關(guān)系式為LgCATP/LgCP=0.9981(圖9)。9個(gè)樣品的變異系數(shù)為(8.59±5.90)%，超出檢測(cè)線性范圍的1個(gè)樣品的濃度為6.43×103CFU/ml，其變異系數(shù)為23.65%。高通量生長曲線法計(jì)數(shù)的 9個(gè)在線性范圍內(nèi)的樣品計(jì)數(shù)值的對(duì)數(shù)(LgCG)與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果的對(duì)數(shù)(LgCP)之間具有極顯著的線性關(guān)系(R2=0.9985,P=3.89× 10-11)，其關(guān)系式為LgCG/LgCP=0.9985(圖9)。9個(gè)樣品的變異系數(shù)為(9.78±7.46)%，超出線性范圍的1個(gè)樣品的濃度為77.00 CFU/ml，其變異系數(shù)為68.43%。

圖9 3種高通量活菌計(jì)數(shù)法與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果比較Fig.9 Comparison of logarithmic counting value three high throughput counting methods for living bacteria(LgC) and logarithmic value of plate counting (LgCP)

上述3種方法與平板計(jì)數(shù)法的比較顯示，ATP發(fā)光法和高通量生長曲線法的曲線斜率很接近1，說明這 2種方法與平板計(jì)數(shù)法得出的結(jié)果高度接近，而MTT法的斜率與1有所偏離，而且在偏低或偏高濃度上有明顯系統(tǒng)誤差，說明這一方法所得結(jié)果存在一定誤差。

3 討論

平板計(jì)數(shù)作為活菌計(jì)數(shù)的最基本方法，通常能應(yīng)用于大多數(shù)需要進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的場合，但在一些研究不同培養(yǎng)條件，例如液體發(fā)酵(高戈等,2017)或固體發(fā)酵(孫靜等,2017)等；理化因素，例如消毒劑或紫外線等處理；藥物制劑，例如中草藥或抑菌劑等；這些對(duì)特定細(xì)菌生長或存活的影響效果時(shí)，需要大量的活菌計(jì)數(shù)工作，而平板計(jì)數(shù)方法由于工作量大，材料消耗大，在用到這些大量研究對(duì)象時(shí)效率很低，且不確定度高(凌云等,2010)，因此，需要高效可靠的活菌計(jì)數(shù)方法。工作效率較高的細(xì)菌計(jì)數(shù)法可采用酶標(biāo)板的高通量OD值測(cè)定，但該方法并不能區(qū)分樣本中的活菌和死菌，而且如果樣本中存在大量帶顏色的或懸浮物等干擾光吸收的物質(zhì)時(shí)(孫靜等,2017)，就難以進(jìn)行直接的OD值測(cè)定。因此，需要其他的活菌計(jì)數(shù)方法以彌補(bǔ)在特定應(yīng)用中的不足。

MTT比色法操作相對(duì)簡單，能滿足高通量操作的需求，適用于較高濃度的活菌數(shù)檢測(cè)，但其檢測(cè)的線性范圍只有2個(gè)數(shù)量級(jí)的跨度。當(dāng)活菌數(shù)較低時(shí)，MTT的反應(yīng)產(chǎn)物過低，從而在OD555 nm值太低而超出檢測(cè)的線性范圍，不適用于檢測(cè)濃度太低或太高的細(xì)菌，由于高通量分析實(shí)驗(yàn)的場合常常會(huì)有細(xì)菌數(shù)量大大偏離MTT檢測(cè)范圍的情況發(fā)生，這種方法實(shí)際上在高通量活菌計(jì)數(shù)的應(yīng)用中受到了較大局限，與之前報(bào)道的MTT比色法在大腸桿菌活菌計(jì)數(shù)研究的結(jié)論相符合(汪志榮等,2011)。對(duì) 7.8×106～2.5×108CFU/ml線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果有一定偏離，5×106CFU/ml以下的檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有明顯偏差。此外，不同種類和不同生理狀態(tài)的細(xì)菌中琥珀酸脫氫酶含量可能不同，對(duì)多種細(xì)菌混合檢測(cè)的適用性可能受影響。

ATP生物發(fā)光法操作更加簡便，是3種方法中檢測(cè)速度最快的，準(zhǔn)確性比MTT法高，反應(yīng)速度較快，能對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)反饋，線性范圍能達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí)的跨度。對(duì) 1×104～3×108CFU/ml跨度的線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果高度吻合，對(duì)104CFU/ml以下的檢測(cè)結(jié)果偏差明顯增加(Chenet al,2006)。在檢測(cè)較低濃度的活菌時(shí)，需要較長的檢測(cè)時(shí)間來收集微弱的發(fā)光，對(duì)于大量樣品的高通量檢測(cè)來說，順序檢測(cè)過程會(huì)造成前后樣品的時(shí)間差太大，ATP的發(fā)光會(huì)逐漸消散而對(duì)準(zhǔn)確性造成顯著影響(Selanet al,1992)。因此，該方法也不適于大樣本量的高通量檢測(cè)。此外，如果樣品中有其他來源的 ATP干擾，也會(huì)對(duì)分析的準(zhǔn)確性產(chǎn)生很大的影響。

高通量生長曲線法準(zhǔn)確性略低于 ATP發(fā)光法，在本研究的手動(dòng)操作條件下，檢測(cè)的線性范圍達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)以上，對(duì)特別低或特別高的活菌數(shù)都能進(jìn)行有效檢測(cè)。對(duì) 100～107CFU/ml跨度的線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果高度吻合，102CFU/ml以下的實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)有誤差增大的可能，與 Brewster(2003)的研究結(jié)果相符。高通量生長曲線法操作耗費(fèi)時(shí)間較長，而且需要定時(shí)對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定，如果完全人工手動(dòng)操作，這個(gè)過程將較為辛苦。該方法不需要借助特別試劑，可以不受試劑缺乏的限制而得以應(yīng)用。如果有自動(dòng)生長曲線測(cè)定儀，那這樣的操作將十分方便，而且能進(jìn)一步增加其檢測(cè)的線性范圍和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜合比較3種高通量方法：ATP生物發(fā)光法與高通量生長曲線法有很好的準(zhǔn)確性，MTT比色法準(zhǔn)確度稍差；而高通量生長曲線法有最寬的線性范圍，也最適合高通量測(cè)定。