周威 黃群 孟冬冬

【關(guān)鍵詞】 OPN;草酸鈣;結(jié)石;發(fā)病機(jī)制

中圖分類號：R195 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.04.018

泌尿系結(jié)石發(fā)病率在人群中居高不下，歐美地區(qū)調(diào)查研究顯示， 5%～10%的人一生中至少發(fā)生1次泌尿系結(jié)石[1]。我國泌尿系結(jié)石平均發(fā)病率達(dá)到6.5%，南方地區(qū)更高，達(dá)到11.6%[2]。近年來，國內(nèi)泌尿系結(jié)石的發(fā)病率呈上升趨勢，并且經(jīng)治療后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率在50.0%以上[3]。尿路結(jié)石以草酸鈣結(jié)石及其混合成分為主要類型。骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）在體外能抑制草酸鈣晶體的成核、生長和聚集，但在體內(nèi)能促進(jìn)草酸鈣結(jié)石形成?，F(xiàn)從OPN的結(jié)構(gòu)、功能、與草酸鈣結(jié)石的關(guān)系等方面做一概述。

1 骨橋蛋白概述及其結(jié)構(gòu)特性

骨橋蛋白又名分泌性磷蛋白-1（SSP1），是一種可溶性蛋白質(zhì)，存在于大多數(shù)體液中[4]，是由314個氨基酸組成的帶負(fù)電荷的磷酸化糖蛋白，分子量為35 kDa。SPP1基因編碼了OPN的五個不同亞型，其中OPN-a、OPN-b和OPN-c均由幾個高度保守的結(jié)構(gòu)域組成，主要包括RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）、識別序列 （GRGDS）、SVVYGLR序列、凝血酶切割位點（RSK）、N-末端富含天冬氨酸序列、鈣結(jié)合位點和C-末端結(jié)合肝素結(jié)構(gòu)域，其不同之處在于每種亞型在信號肽和天冬氨酸結(jié)構(gòu)域之間的連接長度均不同[5]。OPN首先在骨中被發(fā)現(xiàn)，隨后在胎盤、泌尿生殖道等部位及血液、乳汁等體液中也發(fā)現(xiàn)有OPN存在。

骨橋蛋白能發(fā)揮其生物學(xué)活性，是由于其分子內(nèi)部含有兩個鈣結(jié)合區(qū)域、一個RGD序列與一個凝血酶裂解位點。其中，鈣結(jié)合區(qū)域在鈣離子介導(dǎo)或參與的反應(yīng)過程中起重要作用，而后兩者可以促進(jìn)細(xì)胞黏附。RGD序列通過整合素介導(dǎo)參與晶體黏附于上皮細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[6]。而OPN被凝血酶片段裂解后，隱藏的整合素連接位點162SLAYGLR168暴露，繼而結(jié)合整合蛋白α4β1和α9β1[7]。作為細(xì)胞黏附蛋白和細(xì)胞因子，OPN通過與αvβ3-整合素和CD44的相互作用進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。

2 骨橋蛋白的調(diào)節(jié)及其功能

骨橋蛋白在體內(nèi)的表達(dá)受多種物質(zhì)調(diào)節(jié)。一水草酸鈣（COM）在尿路結(jié)石中占比最高，也是重要的OPN 調(diào)節(jié)因素。研究表明，OPN可促進(jìn)體外培養(yǎng)的BSC-1 細(xì)胞表達(dá)OPN[9]。Yan等[10]發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)手術(shù)切除甲狀腺后，不同濃度和時間梯度的促甲狀腺素刺激會增加OPN的表達(dá)。Bouleftour等[11]研究發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素可促進(jìn)小鼠OPN的表達(dá)。彭秀梅[12]在研究激素對牦牛OPN表達(dá)的影響時發(fā)現(xiàn)，黃體酮可明顯促進(jìn)牦牛輸卵管上皮細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)，并且呈計量依賴性，而雌二醇則明顯抑制OPN的表達(dá)。鞠華龍等[13]在研究生長激素對大鼠OPN表達(dá)的影響時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用生長激素后，大鼠正畸牙齒移動時牙周組織中OPN的表達(dá)也受影響。結(jié)扎大鼠單側(cè)輸尿管24 h后，OPN和OPN mRNA 的表達(dá)量升高4倍，說明物理刺激可以影響OPN mRNA的表達(dá)。此外，維素生K3、維生素D3、骨化三醇也能促進(jìn)OPN的合成與分泌。OPN是一種存在于大多數(shù)體液中具有多種功能的蛋白質(zhì)，它主要的功能有：①細(xì)胞黏附，OPN能通過特定的依賴性RGD序列和非依賴性RGD序列結(jié)合細(xì)胞表面的整合蛋白受體，繼而發(fā)揮細(xì)胞黏附作用;②細(xì)胞募集，OPN能指導(dǎo)成纖維細(xì)胞的遷移;③細(xì)胞因子表達(dá)，OPN-CD44的相互作用刺激IL-12產(chǎn)生免疫球蛋白，也能抑制IL-10和IL-4的表達(dá)[14];④與腫瘤發(fā)展相關(guān)，在實體器官腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌等，OPN可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，通過自體吞噬的上調(diào)來增強(qiáng)化學(xué)抗性從而介導(dǎo)腫瘤化療耐藥性[15];⑤礦化作用，F(xiàn)oster等[16]研究發(fā)現(xiàn)OPN具有調(diào)節(jié)牙本質(zhì)和骨的形成和礦化的非冗余作用;⑥細(xì)胞免疫，OPN調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，以與TH-1類似的方式起作用，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[17]。此外，OPN還可以抑制脂肪細(xì)胞分化，也能通過與整合αvβ1相互作用促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，參與骨吸收，加速血管生成。

3 骨橋蛋白與草酸

體外實驗證明，高濃度草酸能通過增加細(xì)胞膜的通透性、促進(jìn)細(xì)胞DNA斷裂等方式使細(xì)胞數(shù)量減少，它能對腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，主要表現(xiàn)在以下2個方面：①促進(jìn)UPTF1（凝血酶原片段1）的mRNA翻譯成UPTF1蛋白，從而介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，損傷腎上皮細(xì)胞，使腎小管上皮細(xì)胞凋亡和壞死;②對腎上皮細(xì)胞的毒性反應(yīng)，包括改變細(xì)胞膜表面特性和細(xì)胞脂質(zhì)、破壞線粒體功能、改變細(xì)胞基因表達(dá)、產(chǎn)生大量的活性氧簇，進(jìn)一步激活各種信號分子和轉(zhuǎn)錄因子，最終導(dǎo)致尿液中某些大分子物質(zhì)在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)[18]。目前認(rèn)為腎上皮細(xì)胞損傷是結(jié)石形成的始動因素，隨著尿液草酸濃度的增加，草酸鈣結(jié)晶增加，草酸鈣晶體沉積能直接增加OPN的表達(dá)。正常情況下，OPN的表達(dá)局限在Henle環(huán)和腎乳頭表面上皮細(xì)胞，而在高草酸尿環(huán)境中，OPN表達(dá)增加，但仍主要局限于髓袢細(xì)段的基底膜間質(zhì)中。然而，在草酸鈣結(jié)晶聚集、沉積后，OPN在近端小管甚至整個腎臟中均有表達(dá)[19]。關(guān)曉峰等[20]通過乙二醇和氯化銨誘導(dǎo)建立高草酸尿癥大鼠模型，隨后測定尿液草酸濃度后發(fā)現(xiàn)OPN表達(dá)量隨著尿液草酸濃度增加而增加，實驗后期隨著草酸濃度的降低而減弱。并且OPN表達(dá)起始于集合管，逐漸向髓袢蔓延，重吸收作用后尿液草酸濃度在集合管達(dá)到峰值，表明尿液草酸濃度可影響腎單位中OPN的表達(dá)，而且高表達(dá)于集合管與髓袢，提示腎集合管與髓袢可能是草酸鈣結(jié)石形成的起始部位。綜上所述，可以認(rèn)為高濃度草酸能損傷腎小管上皮細(xì)胞，使草酸鈣表達(dá)增加，隨后加速草酸鈣晶體聚集、成核、增加晶體滯留，從而促進(jìn)結(jié)石的形成。

4 骨橋蛋白與草酸鈣結(jié)石

4.1 腎組織中的骨橋蛋白與草酸鈣結(jié)石

一般認(rèn)為，骨橋蛋白能抑制草酸鈣晶體的形成。Lieske等[21]研究發(fā)現(xiàn)，COM晶體能迅速結(jié)合腎上皮細(xì)胞，而且濃度越高，結(jié)合速度越快，推測其機(jī)制為OPN與草酸鈣晶體表面黏附相關(guān)位點結(jié)合，從而阻止晶體與腎小管上皮細(xì)胞結(jié)合。Wesson等[22]用乙二醇分別誘導(dǎo)OPN基因敲除的成年小鼠和正常小鼠，形成高草酸尿模型，到第4周后，OPN基因敲除小鼠的腎小管內(nèi)形成大量草酸鈣晶體，而正常小鼠則無晶體形成，提示OPN能抑制草酸鈣結(jié)晶形成。體外實驗表明[23]，OPNAs3（3-磷酸絲氨酸肽）和OPNAs5（5-磷酸絲氨酸肽）濃度越高，二水草酸鈣（COD）在溶液中的成核和生長越慢，并且增加OPN的磷酸化水平，對COD的抑制作用更強(qiáng)更穩(wěn)定。為了研究OPN在COM結(jié)石形成過程中的作用，Langdon等[24]通過向人造尿液中添加OPN誘導(dǎo)草酸鈣結(jié)晶形成，然后用掃描電子（SEM）和共聚焦顯微鏡研究OPN-COM相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低濃度的OPN中形成的COM晶體呈拉長的六邊形，隨著OPN濃度的增加，COM晶體形態(tài)逐漸變化，最終變成啞鈴形晶體。進(jìn)一步測量單個晶體的體積時發(fā)現(xiàn)，隨著OPN濃度的增加，COM晶體體積不斷減小，從而可以推斷OPN通過抑制草酸鈣結(jié)晶而抑制草酸鈣結(jié)石的形成。關(guān)于OPN在草酸鈣結(jié)石形成過程中的作用，部分學(xué)者卻有不同的見解。Mo等[25]發(fā)現(xiàn)約10%的OPN基因敲除小鼠和14.3%THP（Tamm-Horsfall蛋白）基因敲除小鼠在腎乳頭處自發(fā)形成磷酸鈣沉淀，而正常小鼠則未出現(xiàn)任何沉淀，并且這2類小鼠的尿液均具有促進(jìn)一水草酸鈣晶體與腎上皮細(xì)胞黏附的能力。歐善際[26]用原位反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)測定大鼠體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞OPN mRNA 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在受COM刺激后，大鼠腎小管上皮細(xì)胞OPN表達(dá)增強(qiáng)，但高濃度的COM 卻降低OPN表達(dá)。Hirose等[27]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)乙醛酸鹽給藥后，腎皮質(zhì)-髓質(zhì)連接處OPN蛋白表達(dá)逐漸增加，OPN mRNA表達(dá)從12小時開始增加，在24小時逐漸下降。在超顯微結(jié)構(gòu)觀察中，6小時后OPN開始出現(xiàn)在腎遠(yuǎn)端小管的細(xì)胞晶核和塌陷的線粒體中，并在12小時后在腎小管管腔中逐漸檢測到。在OPN基因敲除小鼠腎細(xì)胞中，24小時可見到塌陷的線粒體，但未見有晶核形成。表明腎小管細(xì)胞損傷后，OPN在損傷的細(xì)胞器中聚集，從而成為晶核形成的開始。同樣的，吳敬彰等[28]研究OPN在結(jié)石患者腎組織中的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，結(jié)石組患者腎組織中的OPN表達(dá)量顯著高于對照組。趙明等人[29]在研究骨橋蛋白對大鼠發(fā)生草酸鈣腎臟結(jié)石的影響時發(fā)現(xiàn)，OPN siRNA組OPN蛋白表達(dá)水平顯著低于空載組，顯著高于對照組，而OPN siRNA組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)草酸鈣結(jié)石均顯著低于空載組，顯著高于對照組，從而可以認(rèn)為OPN具有促進(jìn)草酸鈣腎結(jié)石形成的作用。鄧茂放等[30]在研究烏梅提取物對腎結(jié)石模型大鼠腎功能的保護(hù)作用及機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，模型組和實驗組腎組織中OPN蛋白免疫組化評分明顯高于正常組，模型組大鼠較正常組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中OPN蛋白表達(dá)量增多，由此可以推斷OPN促進(jìn)結(jié)石形成。以上研究都表明OPN在促進(jìn)腎小管中滯留的晶體轉(zhuǎn)化為腎結(jié)石過程中起關(guān)鍵作用，甚至導(dǎo)致臨床尿石癥。

4.2 尿液中的骨橋蛋白與腎結(jié)石

一般情況下，尿液中鈣離子、草酸根離子處于過飽和狀態(tài)，但大多數(shù)人不形成結(jié)石，表明尿液中存在某些抑制結(jié)石形成的物質(zhì)，可通過影響晶體結(jié)晶而抑制草酸鈣結(jié)石形成。目前發(fā)現(xiàn)，存在尿液中的大分子結(jié)石抑制物包括：THP、OPN、枸櫞酸鹽、間α胰蛋白酶抑制物、S100A8蛋白、乙二胺四乙酸等[31]。其中，尿液中的OPN在抑制結(jié)石晶體形成過程起到關(guān)鍵作用。腎集合管及髓袢等部位合成并分泌OPN到尿液中，起到抑制結(jié)石形成的作用。OPN 的分泌無性別差異，與鈣、肌酐排泄無直接關(guān)系，而與尿量的變化呈負(fù)相關(guān)[32]。Asplin 等[33]研究OPN對草酸鈣晶體形成的作用時發(fā)現(xiàn)，抑制半數(shù)COM晶體生長、聚集的OPN濃度分別為（16±2）nmol/L、（28±4）nmol/L，而正常人尿液OPN 的濃度卻高達(dá)（131±13）nmol/L，完全能夠抑制尿草酸鈣晶體的生長、聚集。Yasui等[34]測定結(jié)石患者尿液OPN濃度后發(fā)現(xiàn)，其濃度和排泄率均降低，并推測結(jié)石患者尿液中OPN含量降低可能有2種原因：①OPN合成量不足，使尿液中OPN濃度不足以抑制草酸鈣結(jié)石的形成;②OPN的合成量正常，由于OPN摻入生長的結(jié)石中，經(jīng)尿液排出的OPN減少，也不足以抑制結(jié)石的形成。Thurgood等[35]在研究晶體內(nèi)和表面結(jié)合的OPN對COD晶體的影響時發(fā)現(xiàn)，在濃度分別為0 mg/L、1 mg/L和5 mg/L的OPN中，尿液中形成COD晶體的大小分別為21.9 μm、19.3 μm和16.5 μm，表明OPN抑制COD晶體生長，并且抑制作用呈劑量依賴性。王炎等人[36]在研究加味健脾益腎方對腎結(jié)石術(shù)后尿骨橋蛋白的影響時發(fā)現(xiàn)，治療組治療2周、4周時，尿OPN含量比治療前明顯升高，說明加味健脾益腎方可以通過提高尿中OPN水平進(jìn)而抑制草酸鈣結(jié)石形成。也有學(xué)者持相反的觀點，Konya等[37]研究草酸鈣晶體聚集和生長的抑制活性過程中發(fā)現(xiàn)，固定在膠原顆粒表面的OPN能增加草酸鈣晶體的黏附和聚集，并且可以增加新形成的晶體的黏附力，高濃度的草酸鈣也能將OPN包裹，成為結(jié)晶形成的始發(fā)部位，從而促進(jìn)草酸鈣結(jié)石的形成。

5 小結(jié)和展望

泌尿系結(jié)石是一種由多因素參與、形成過程非常復(fù)雜的疾病，發(fā)病機(jī)制目前還有待研究。OPN作為多功能的磷酸化糖蛋白，在結(jié)石晶體聚集、成核、生長環(huán)節(jié)中扮演著重要的角色。盡管已經(jīng)對OPN與泌尿系結(jié)石的形成關(guān)系做了大量研究，但目前仍不能明確其在草酸鈣結(jié)石形成中的具體作用。對OPN的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)節(jié)、與草酸的關(guān)系等方面的研究，有助于為草酸鈣形成機(jī)制的研究提供理論指導(dǎo)與依據(jù)，對于泌尿系結(jié)石的預(yù)防、降低結(jié)石病在人群中的發(fā)病率有一定的指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2019-01-06 修回日期：2019-01-21）

（編輯：梁明佩）