潘 婷，陳 歡，劉攀旺，徐世軍△

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病藥物整合轉(zhuǎn)化研究所，成都 611137)

關(guān)節(jié)滑膜增生和成纖維細(xì)胞(synovial fibroblast cell，F(xiàn)LS)炎性浸潤(rùn)是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的主要病理特征[1-2]。炎癥的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)極為密切[3]。琥珀酸由琥珀酰CoA合成酶催化琥珀酰CoA生成，同時(shí)高能硫酯鍵水解生成GTP。研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸在RA患者關(guān)節(jié)滑膜液中大量累積，并被認(rèn)為是導(dǎo)致滑膜病理變化的關(guān)鍵因素之一[4-5]。琥珀酸通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體91(G protein-coupled receptor 91，GPR91)促進(jìn)炎性因子IL-1β釋放，啟動(dòng)并加速關(guān)節(jié)滑膜病變[6-7]。知母是歷代治療痹癥的常用高頻中藥，也是治痹經(jīng)方桂枝芍藥知母湯、白虎加桂枝湯、通陽(yáng)宣痹湯等關(guān)鍵藥物，具有顯著的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、影響皮質(zhì)激素及血糖水平的作用[8-10]。皂苷是其含量最高、種類(lèi)最多的成分，具有明顯抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂的藥理作用[9]，但鮮少有關(guān)于知母皂苷抗RA的研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物

32只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量160～200 g，購(gòu)于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(動(dòng)物合格證號(hào)0010716)。大鼠均飼養(yǎng)于22 ℃～24 ℃，明暗周期為12 h/12 h的環(huán)境中，自由攝食飲水。

1.2 藥品與試劑

知母總皂苷(寶雞辰光生物制藥股份有限公司，批號(hào)20160917)；醋酸地塞米松(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)161231)；完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)(sigma公司，貨號(hào)F5881-10 ml)；GPR91抗體(Abcam公司，批號(hào)ab140795)；IL-1β ELISA試劑盒(MultiSciences，批號(hào)2301B71055)；琥珀酸(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-11052307)；富馬酸(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)F-016-170426)；琥珀酸脫氫酶測(cè)試盒(南京建成生物科技有限公司，批號(hào)A022)。

1.3 主要儀器

PV-200足趾容積測(cè)量?jī)x，成都泰盟；Agilent1260高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Ultimate AQ-C18，月旭科技股份有限公司；CX22型顯微鏡(帶數(shù)碼成像系統(tǒng))，德國(guó)LEICA公司。

2 方法

2.1 造模與分組

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質(zhì)量和正常足容積完全隨機(jī)分成4組，通過(guò)抓鬮確定組名，分別為空白組(NG)、模型組(AA)、陽(yáng)性組(DXMS，0.0875 mg/kg)、知母總皂苷組(TT，200 mg/kg)每組各8只。除NG組大鼠右后足足跖皮下注射0.1 ml生理鹽水外，其余各組大鼠均于同一位置緩慢注射0.1 ml CFA。造模第14天開(kāi)始藥物干預(yù)，給藥體積為10 ml/kg，NG組和AA組給予蒸餾水，每日1次，連續(xù)28 d。

2.2 觀(guān)察指標(biāo)與方法

2.2.1 足腫脹度 造模前測(cè)定大鼠右后足足容積2次，計(jì)算均值作為正常足容積。造模后每隔6 d于同一位置測(cè)定足容積1次。以造模后足容積與正常足容積的差值作為大鼠足腫脹度。

2.2.2 足圍 造模前，采用皮尺測(cè)量大鼠造模側(cè)足跖部周長(zhǎng)2次，求取平均值當(dāng)作正常足圍。造模后每隔6 d測(cè)定大鼠足圍1次，以造模后足圍與正常足圍的差值作為足圍變化。

2.2.3 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜的病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察 表1顯示，末次給藥1 h后處死大鼠，剪取大鼠右后足踝關(guān)節(jié)，注射4%多聚甲醛溶液于關(guān)節(jié)腔內(nèi)并浸泡于固定液中。脫鈣后經(jīng)石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色、封片，最后鏡檢。

2.2.4 外周血清IL-1β含量 末次給藥1 h后取腹主動(dòng)脈血，3500 r/m離心10 min取上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)外周血清中IL-1β含量。

表1 滑膜組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.5 滑膜組織中琥珀酸脫氫酶活性及琥珀酸、富馬酸含量測(cè)定 組織勻漿液制備：將滑膜組織用液氮凍硬后立即研磨成粉，按1∶10的比例(W/V)加入生理鹽水進(jìn)行勻漿。SDH酶活性檢測(cè)：取滑膜組織勻漿液，參照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SDH酶活性。琥珀酸、富馬酸含量測(cè)定：吸取250 μL勻漿液于EP管中，添加等量0.5 mol/L高氯酸混勻。冰浴10 min后，14000 g 4℃離心20 min，取300 μL上清液于進(jìn)樣瓶。標(biāo)準(zhǔn)品配制：采用雙蒸水配制琥珀酸(1800 μmol/L)與富馬酸(200 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)品。流動(dòng)相配制：稱(chēng)量磷酸二氫鉀加超純水定容，調(diào)PH至2.5，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，超聲15 min。等度洗脫，流速1 ml/min，波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.6 免疫組化法檢測(cè)滑膜組織GPR91蛋白表達(dá) 2.2.3項(xiàng)下石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，采用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸緩沖液(pH=6.0)修復(fù)抗原。隨后加入兔抗GPR91抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育15 min，HRP工作液孵育15 min。最后進(jìn)行DAB染色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，采用image-pro Plus 6.0軟件測(cè)定GPR91蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度，并用IOD值表示。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 知母總皂苷對(duì)模型大鼠足腫脹度及足圍的影響

表2、3顯示，致炎后模型大鼠足部出現(xiàn)明顯紅腫，AA組大鼠足腫脹度逐漸增加，第28天達(dá)到峰值；經(jīng)知母總皂苷治療4周后，大鼠腫脹度較模型組明顯降低(P<0.05)。與NG組比較，AA組大鼠足圍顯著增加(P<0.05)，TT組大鼠的足圍自造模后第28天起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束較AA組有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 知母總皂苷對(duì)AA模型大鼠足腫脹度的影響

注：與空白組比較:##P<0.01；與模型組比較:**P<0.01

表3 知母總皂苷對(duì)AA模型大鼠足圍的影響

注：與空白組比較:##P<0.01；與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01

3.2 知母總皂苷對(duì)模型大鼠病理形態(tài)學(xué)影響

圖1表4顯示，NG組踝關(guān)節(jié)滑膜正常，未見(jiàn)明顯病理改變，AA組大鼠滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，滑膜細(xì)胞增生較明顯。藥物干預(yù)后，大鼠滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與滑膜細(xì)胞增生均明顯減輕(P<0.05)。

注：a.空白組；b.模型組；c.陽(yáng)性組；d.知母總皂苷組；s.滑膜細(xì)胞增生，i.炎性細(xì)胞浸潤(rùn)圖1 大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化(HE，20×10)

表4 知母總皂苷對(duì)AA模型踝關(guān)節(jié)病理的影響比較(分)

3.3 知母總皂苷對(duì)模型大鼠血清IL-1β水平的影響

表5顯示，AA組血清IL-1β水平顯著高于NG組(P<0.01)。與AA組比較，TT組大鼠血清IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。

表5 知母總皂苷對(duì)大鼠血清IL-1β含量及滑膜組織琥珀酸、富馬酸含量、SDH酶活性的影響

注：與空白組比較:#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01(n代表例數(shù))

3.4 知母總皂苷對(duì)滑膜組織琥珀酸堆積影響

表5顯示，與NG組比較，AA組滑膜組織中琥珀酸含量明顯升高(P<0.05)。與AA組比較，TT組滑膜組織中琥珀酸積累被顯著抑制(P<0.05)。

3.5 知母總皂苷對(duì)滑膜組織SDH酶活性及富馬酸含量的影響

表5顯示，與NG組比較，AA組滑膜樣本中的富馬酸含量明顯降低(P<0.05)，SDH酶活性雖有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與AA組比較，TT組滑膜樣本中SDH酶活性及富馬酸含量均有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.6 知母總皂苷對(duì)滑膜組織GPR91蛋白表達(dá)的影響

圖2顯示，與NG組比較，AA組滑膜樣本中GPR91蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。與AA組比較，TT組GPR91蛋白水平明顯降低(P<0.05)。

注：與空白組比較:#P<0.05；與模型組比較:*P<0.05。a.空白組；b.模型組；c.陽(yáng)性組；d.知母總皂苷組。棕黃色代表GPR91，藍(lán)色代表細(xì)胞核。圖2 知母總皂苷對(duì)大鼠滑膜組織琥珀酸含量及GPR91表達(dá)的影響(10×10)

4 討論

AA動(dòng)物模型的病理特征和RA的臨床表現(xiàn)在關(guān)節(jié)腫脹、滑膜炎癥、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等方面具有高度相似性，且造模方法簡(jiǎn)單有效[11]。模型大鼠足腫脹程度和關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)學(xué)的改變，可以反映藥物的療效和作用強(qiáng)度，因此常用于藥物有效性評(píng)價(jià)和藥物篩選。我們研究發(fā)現(xiàn)，知母總皂苷不僅可以拮抗CFA所致的模型大鼠足腫脹和足圍異常增大，而且可以改善關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示知母總皂苷具有改善AA模型大鼠滑膜免疫性炎癥的作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)局部琥珀酸異常堆積參與了RA的發(fā)病進(jìn)程。具體表現(xiàn)為首先胞外琥珀酸與其受體GPR91的結(jié)合，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放如IL-1β、NO、PG等多種炎性介質(zhì)，啟動(dòng)或加劇關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng)[6]；同時(shí)血管生成異常增加促使外周白細(xì)胞向關(guān)節(jié)滑膜的趨向遷移和黏附，加劇滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)，知母總皂苷可以顯著減少模型大鼠滑膜琥珀酸堆積。GPR91是琥珀酸的特異性細(xì)胞膜受體，并且在多種炎性免疫相關(guān)細(xì)胞中表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(也稱(chēng)DC細(xì)胞)和FLS，參與后續(xù)炎癥反應(yīng)[13]。琥珀酸可增強(qiáng)DC細(xì)胞的遷移和抗原提呈能力，GPR91敲除后該作用消失[13]。琥珀酸激活巨噬細(xì)胞GPR91受體可導(dǎo)致IL-1β釋放，GPR91激活后可以活化胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路和蛋白激酶C，導(dǎo)致下游多條炎癥信號(hào)途徑的激活，促使多種炎癥介質(zhì)的釋放而放大炎癥效應(yīng)[15]，因此目前GPR91被認(rèn)為是治療RA的一個(gè)潛在靶標(biāo)[14]。我們研究發(fā)現(xiàn)，AA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜GPR91蛋白顯著高表達(dá)，外周血清IL-1β含量顯著增高，經(jīng)知母總皂苷干預(yù)后GPR91蛋白表達(dá)顯著降低，外周血清IL-1β水平顯著降低。綜上，知母總皂苷拮抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用與抑制琥珀酸/GPR91/IL-1β信號(hào)途徑有關(guān)，但對(duì)琥珀酸代謝影響不明顯，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。