(1.浙江工業(yè)大學 海洋學院，浙江 杭州 310014；2.杭州食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310014)

近年來，營養(yǎng)保健食品被視為一種較為直接的營養(yǎng)來源。研究發(fā)現(xiàn)：營養(yǎng)保健品在預防疾病方面的有效性取決于對保持活性成分的生物利用度[1]。β-胡蘿卜素是一種常見的抗氧化劑，但是由于其性質(zhì)不穩(wěn)定以及生物利用度低等缺陷，在食品工業(yè)中的應用受到了限制。為解決這一問題，有學者提出可以利用不同的包埋方法包封β-胡蘿卜素以提高其生物利用率[2]。目前包封活性物質(zhì)的方法主要有噴霧干燥、噴霧流化床干燥和靜電噴霧干燥等。噴霧干燥法容易使熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)發(fā)生熱降解，從而影響其生物利用率及包埋率[3]；噴霧流化床干燥法制備的顆粒尺寸較大，霧化噴槍易堵塞[4]；相比之下，靜電噴霧干燥法易于控制，作用條件溫和，能夠有效減少生物活性物質(zhì)的變性[5]。目前已有成功采用靜電噴霧技術(shù)包封生物活性成分的先例[6]，但是這些研究都沒有系統(tǒng)地考察乳化劑對顆粒的影響。普魯蘭多糖是一種由出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的胞外水溶性黏質(zhì)非離子多糖，與其他多糖相比，該糖具有規(guī)則的線性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使其溶解度較大且結(jié)構(gòu)彈性較大[7]。普魯蘭多糖水溶液具有較高的鏈纏結(jié)濃度，在靜電噴霧過程中可以形成較為穩(wěn)定的射流，從而得到較為均一的微納米顆粒。筆者采用3種常見的可用作乳化劑的蛋白質(zhì)結(jié)合普魯蘭多糖，制備普魯蘭多糖-蛋白質(zhì)乳液來包封β-胡蘿卜素，利用超聲乳化技術(shù)增加蛋白質(zhì)與普魯蘭多糖的結(jié)合。通過對乳化體系的穩(wěn)定性及電噴霧顆粒的尺寸及包封效果進行了考察，研究了不同種類蛋白質(zhì)作為乳化劑制備的乳液對靜電噴霧顆粒的影響，探討了采用普魯蘭多糖結(jié)合蛋白質(zhì)包封β-胡蘿卜素的可行性，為后續(xù)不同包封體系的制備提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，源葉生物有限公司(上海)；乳清蛋白，源葉生物有限公司(上海)；酪蛋白酸鈉，阿拉丁試劑；普魯蘭多糖，阿拉丁試劑；中鏈甘油三酯(MCT)，博星化工有限公司(武漢)；β-胡蘿卜素(HPLC 90%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

TEADFS-103-21電紡絲設備，北京新銳佰納科技有限公司；磁力攪拌器、高速剪切機，德國艾卡儀器有限公司；FS-2000T超聲波處理，生析超聲儀器公司；MCR52流變儀，英國馬爾文儀器有限公司；DDSJ-308A電導率測定儀，雷滋儀電科學儀器股份有限公司；動態(tài)光散射粒徑及zata電位分析儀DLS，美國布魯克海文儀器公司；AVATAR370傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Q20差示掃描量熱儀，美國TA儀器；VEGA 3 SBH臺式鎢燈絲掃描電鏡，泰思肯貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳液的制備

實驗方法參考文獻[8]并稍作改動。步驟為

1) 稱取12 g普魯蘭多糖，用磁力攪拌器恒速攪拌，制備質(zhì)量濃度為8%的普魯蘭多糖水溶液。

2) 分別取0.1 g的乳清蛋白、大豆分離蛋白和酪蛋白酸鈉，加入到10 mL均勻的普魯蘭多糖水溶液中，振蕩攪拌，使蛋白質(zhì)溶解并均勻分散于普魯蘭多糖水溶液中，制備水相。

3) 取0.01 gβ-胡蘿卜素，溶于中鏈甘油三酯中，制備質(zhì)量濃度為0.1%的β-胡蘿卜素的油相。

4) 在水相中加入油相，制備油相質(zhì)量分數(shù)為10%的乳液。

5) 乳液在12 560 r/min轉(zhuǎn)速下預乳化3 min后超聲處理，超聲功率為600 W。

設置未超聲處理的乳液為對照組，所制備的乳液均在室溫下儲藏。

1.3.2 粒徑分析

采用動態(tài)光散射粒徑及zata電位分析(DLS)測定乳液粒度。將測乳液稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.001 mg/mL，進行粒度測定，實驗在室溫下進行3次，取平均值。

1.3.3 電導率測定

乳液的電導率對靜電噴霧產(chǎn)生一定影響，采用電導率測定儀(DDSJ-308A)在室溫下測定乳液電導率，測量3次，取平均值。

1.3.4 納米顆粒制備及靜電噴霧工藝

納米顆粒制備及靜電噴霧工藝為

1) 使用鋁箔覆蓋接收器接收制備的顆粒，調(diào)節(jié)噴射針頭與接收器之間的距離為20 cm。

2) 噴射過程采用注射泵驅(qū)動，控制乳液流速為0.36 mL/h，靜電紡絲設備電壓調(diào)節(jié)為8～10 kV進行顆粒制備。

3) 將附著在錫箔紙上的產(chǎn)品取下進行后續(xù)顆粒表征測試。

1.3.5 電子掃描顯微鏡(SEM)表征

通過臺式電鏡掃描儀(捷克TESCAN VEGA 3 SBH)觀察封裝結(jié)構(gòu)的形態(tài)。在掃描電鏡成像之前，取小塊靜電噴霧產(chǎn)品粘在導電膠上，經(jīng)過噴金處理后放入SEM電鏡試驗倉進行測試。檢測時工作電壓為15 kV，工作距離為8 mm，放大倍數(shù)為8 000，纖維直徑分布和平均值采用Image-Pro Plus計算。

1.3.6 傅里葉紅外光譜(ATR-FTIR)表征

使用FT-IR測量粉末狀乳清蛋白、酪蛋白、大豆分離蛋白、普魯蘭多糖和β-胡蘿卜素。取少量樣品分散在光譜級溴化鉀中充分研磨，混合均勻，壓片，測試。將靜電噴霧制備的固體產(chǎn)品剪裁成適當大小，采用ATR-FTIR進行紅外光譜測試。在波數(shù)4 000～600 cm-1和光譜分辨率為4 cm-1的平均紅外區(qū)域進行光譜分析。

1.3.7 差式掃描量熱法(DSC)表征

差式掃描量熱法以樣品吸熱或放熱的速度，即熱流率為縱坐標，以溫度或時間為橫坐標，測試制備的顆粒的熱性能。差式掃描量熱儀在20～240 ℃，升溫速率5 K/min，氮氣條件下進行評價[9]。

1.3.8 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析使用Origin 9.1進行，使用單因素方差分析(ANOVA)測定所有報告的統(tǒng)計學差異，p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液粒徑及電導率分析

通過乳液的動態(tài)光散射粒徑測量可以發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過超聲處理后乳液液滴的尺寸和多分散指數(shù)均顯著降低，這可能是因為超聲波的機械振動和空化作用的作用力使乳液液滴在劇烈震動下破裂[10]，進而形成較為均一且粒徑較小的液滴。超聲處理的乳液多分散指數(shù)(PDI)比未超聲處理的乳液要小，表明納米乳液的粒徑分布更窄。表1列出了未采用超聲乳化和經(jīng)過超聲乳化處理的以酪蛋白(SC)、大豆分離蛋白(SPI)和乳清蛋白(WP)為乳化劑的乳液及電噴霧顆粒的粒徑和不同的乳液電導率數(shù)值。

表1 乳液物理表征1)Table 1 Physical characterization of emulsion

注：1) 不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

乳液電導率關(guān)系到靜電噴霧能否成功，超聲乳化的乳液與未超聲乳化的乳液相比，電導率呈現(xiàn)明顯增加的趨勢，說明超聲波對乳液系統(tǒng)的高強度破碎作用對乳液電導率有影響。有研究發(fā)現(xiàn)：使用高強度超聲波處理乳清蛋白、大豆分離蛋白和酪蛋白溶液均未引起電導率的顯著變化[11]。因此在本次研究中經(jīng)過超聲乳化的乳液電導率均有所下降，可能是樣品中含有的普魯蘭多糖引起的。多糖在超聲波中具有極高的運動加速度，會產(chǎn)生激烈的變化，這種快速變化的機械運動會引起多糖這類生物大分子主鏈中一些化學鍵斷裂但不會使多糖化學性質(zhì)完全改變[12]。

2.2 電子掃描顯微鏡(SEM)表征

乳液的性質(zhì)不僅對乳液靜電噴霧能力有影響，對靜電噴霧制備的顆粒結(jié)構(gòu)也有重要影響。圖1顯示了不同乳液靜電噴霧后獲得的顆粒結(jié)構(gòu)的SEM圖像，從圖1中可以看出：不同的乳化方法制備得到的顆粒形態(tài)不同，未經(jīng)過超聲乳化的乳液靜電噴霧顆粒得到球形微米級顆粒結(jié)構(gòu)，經(jīng)過超聲乳化的乳液靜電噴霧得到球形的亞微米顆粒結(jié)構(gòu)，且顆粒形狀更為均一。這一現(xiàn)象可由未超聲乳化處理的乳液液滴具有較大的平均直徑作為解釋，另一方面當?shù)鞍踪|(zhì)的量不足以完全覆蓋油滴表面時油滴表面上吸附的蛋白質(zhì)分子團會遷移到空氣-水界面導致乳液內(nèi)部油滴聚結(jié)增大液滴密度，從而影響顆粒的粒徑尺寸[13]。

乳液液滴原有液滴尺寸會對電噴霧顆粒尺寸產(chǎn)生影響，對乳液顆粒的電鏡掃描圖分析得到乳液電噴霧顆粒平均粒徑，見表1，乳液電噴霧顆粒粒徑分布，見圖2。由于大豆分離蛋白表面的疏水基團較少，使大豆分離蛋白更容易與油包水顆粒發(fā)生聚集、沉降，無法與結(jié)合脂溶性活性物質(zhì)的液滴形成穩(wěn)定的顆粒[14]，造成乳液粒徑較大。

2.3 傅里葉紅外光譜(ATR-FTIR)分析

FT-IR光譜用來考察顆粒中各物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)，以及蛋白質(zhì)和普魯蘭多糖之間可能存在的相互作用。圖3分別顯示了電噴霧顆粒的紅外光譜和酪蛋白酸鈉、大豆分離蛋白、乳清蛋白和普魯蘭多糖的紅外光譜。在1 600～1 700 cm-1處和1 510～1 530 cm-1處出現(xiàn)的峰值是蛋白質(zhì)的主要特征峰，β-胡蘿卜素中反式共軛雙鍵的伸縮振動在964 cm-1處有最強吸收峰；在未超聲處理的乳液中1 600～1 700 cm-1處和1 510～1 530 cm-1處出現(xiàn)的峰值沒有發(fā)生明顯位移，說明在未超聲處理的乳液中蛋白質(zhì)與普魯蘭多糖沒有發(fā)生化學鍵合；靜電噴霧顆粒與原料粉末的紅外峰基本一致，說明在靜電噴霧過程中不造成分子結(jié)構(gòu)的改變[15]。通過電噴霧顆粒在964 cm-1的特征吸收峰的情況可以判斷：β-胡蘿卜素在顆粒中的包封情況，無論是何種乳化方法，在大豆分離蛋白、酪蛋白、乳清蛋白與普魯蘭多糖形成的封裝結(jié)構(gòu)中，β-胡蘿卜素的特征吸收峰都發(fā)生了改變，該變化說明β-胡蘿卜素與蛋白質(zhì)發(fā)生了氫鍵相互作用，對蛋白質(zhì)構(gòu)象產(chǎn)生影響，導致吸收峰發(fā)生位移。

2.4 納米顆粒熱學性能(DSC)分析

圖4為不同樣品未經(jīng)過超聲處理和超聲處理制備的乳液的DSC曲線。DSC曲線顯示：所有的樣品在60 ℃和80 ℃附近都有一個平緩的吸收峰，可能是某些被蒸發(fā)或融化的雜質(zhì)產(chǎn)生的微弱吸收峰;超聲乳化處理的大豆分離蛋白乳液在吸熱峰前出現(xiàn)兩個較小的放熱峰，110 ℃附近出現(xiàn)的放熱峰可能是由部分樣品先熔融后冷卻結(jié)晶導致；胡蘿卜素在高于103 ℃的溫度下會發(fā)生蒸發(fā)降解現(xiàn)象，推測在110 ℃附近出現(xiàn)的吸收峰是由β-胡蘿卜素氧化導致。超聲乳化處理的乳液DSC曲線中110 ℃附近的吸收峰面積比高速剪切乳化的乳液大，由此得到超聲乳化處理的乳液中β-胡蘿卜素與普魯蘭多糖/蛋白質(zhì)結(jié)合的氫鍵更多，說明超聲乳化處理的乳液靜電噴霧顆粒中β-胡蘿卜素的負載量更多，也即超聲乳化對于增加生物活性成分的包封效率有積極的作用。

圖2 乳液電噴霧顆粒尺寸分布Fig.2 Size distribution of emulsion electrospraying particles

1—UH大豆分離蛋白；2—US乳清蛋白；3—US大豆分離蛋白；4—UH乳清蛋白；5—US酪蛋白；6—UH酪蛋白

1—大豆分離蛋白；2—普魯蘭多糖；3—乳清蛋白；4—酪蛋白；5—β-胡蘿卜素

1—大豆分離蛋白/普魯蘭多糖顆粒;2—酪蛋白/普魯蘭多糖顆粒;3—乳清蛋白/普魯蘭多糖顆粒圖4 乳液的DSC曲線Fig.4 DSC curve of emulsion

3 結(jié) 論

筆者采用超聲方法制備乳液后通過乳液靜電噴霧技術(shù)制備顆粒，并對顆粒進行表征，測量了所有乳液顆粒尺寸和電導率等物理性質(zhì)以及靜電噴霧顆粒尺寸及分布、質(zhì)構(gòu)等指標，發(fā)現(xiàn)超聲乳化的乳液粒徑更小且分布更為均勻。通過傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)：蛋白質(zhì)與普魯蘭多糖沒有發(fā)生化學鍵合，蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合對于它們各自的構(gòu)象并未產(chǎn)生影響，但是超聲乳化對于增加生物活性成分的包封效率有積極的作用。實驗數(shù)據(jù)為后續(xù)進一步深入研究提供了理論基礎。